自噬与糖尿病睾丸损伤相关性研究进展

张 欣 马小茹

(佳木斯大学 基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

糖尿病是一种全球流行病，目前影响全球4亿多成年人，预计到2040年将增加到6亿多人[1]。这是一种以高血糖为特征的复杂的慢性代谢系统疾病，由胰岛素作用和/或分泌受损引起，易引发血管并发症,可导致多器官功能损伤和衰竭，男性睾丸损伤是糖尿病常见的慢性并发症之一[2]。随着糖尿病的发病率增高，男性睾丸损伤导致的不育症的患者也日益增多。研究显示[3]，糖尿病生殖损伤是导致男性不育症的重要原因之一，对人类的生殖健康具有严重的危害。该病的特点是性器官病变，性激素水平紊乱和精子细胞结构缺陷。其病因和发病机制复杂，是多因素的，包括肥胖[4]，高血糖[5]，脂代谢紊乱以及年龄，病程等。这都与糖尿病引起的男性生殖障碍有着密切关系。近年来，随着对自噬的研究越来越深入，人们认识到糖尿病男性睾丸损伤的发生发展过程与自噬的参与密不可分[6]，自噬的调控极可能会成为糖尿病男性睾丸损伤新的潜在治疗靶点。

自噬存在于所有真核生物中，是受自噬相关蛋白(ATG)调控的细胞内降解系统，细胞物质通过该系统被递送至溶酶体并在溶酶体中降解。然而，自噬的目的不是简单地消除这些物质成分，而是作为一种动态的循环系统，为细胞修复和体内平衡产生新的构件和能量[7，8]。它可以通过单个或多个信号路径，通过各种内部或外部刺激来触发。此外，在不利的情况下，低氧、活性氧(ROS)和未折叠蛋白的积累也可引起自噬作为细胞保护机制。自噬体的生物发生始于起始的吞噬膜[9]，然后，激活的UNC-51样激酶1(ULK1)复合物被募集到起始吞噬细胞膜上，并使膜上的磷脂酰肌醇磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(PI3P)[10]。PI3P将效应蛋白吸收到该膜上，随后，吞噬细胞膜经历伸长，延伸阶段需要ATG5-ATG12偶联系统和微管相关蛋白轻链3(LC3)/ATG8偶联系统，然后形成双膜自噬体[11]。成熟的自噬体与溶酶体融合以形成自溶体。自噬不仅通过降解非必需的细胞质成分来提供能量，还能够维持细胞体内稳态。有趣的是，有研究[12]发现，暴露于外源性应激刺激后，自噬的抑制作用可促进睾丸支持细胞的存活，研究认为过度的自噬反而会加速细胞的凋亡。研究数据表明自噬的抑制是解释支持细胞(SC)应对压力的稳健性的可能机制。这更加证明了一点：自噬是把双刃剑，且其发挥保护作用的机制也是有两面性的。有实验研究发现，链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠睾丸中自噬相关蛋白Beclin1，LC3的表达明显降低，这说明了在糖尿病状态下睾丸组织自噬被抑制[13]。根据各种实验数据和现象证明，自噬参与了糖尿病睾丸损伤的发生发展，值得引起更多的关注。因此，就男性睾丸组织的自噬现象以及糖尿病男性睾丸损伤自噬相关信号通路的研究进展作一综述。

1 睾丸细胞的自噬现象

睾丸是男性主要的生殖器官，由曲精细管和间质细胞组成，其生精作用和分泌性激素作用共同促进精子的生长发育，并保证正常的性功能。研究表明，睾丸组织中均有不同水平的自噬，如睾丸支持(sertoli)细胞、睾丸间质(leydig)细胞、脂质吞噬。尤其脂质吞噬[14]的自噬现象研究更为新颖。

1.1 睾丸支持(sertoli)细胞

支持细胞呈不规则的高锥体形，细胞基部附着在基膜上，顶部伸至曲精小管腔面，是睾丸结构的第二大特征，睾丸不能在没有支持细胞帮助的情况下产生成熟的生殖细胞。应充分认识到它们在睾丸组织中的中心位置[15]，其在男性生殖器官中的生精功能中发挥着重要的作用。支持细胞受损以镜下大量生殖细胞脱落等形态变化为典型特征，几乎参与了所有睾丸损伤生殖障碍的病理发展过程。支持细胞或已成为男性不育的治疗靶点。

睾丸支持细胞存在着较明显的自噬现象，并且在睾丸的正常生长发育和男性不育症的病理发展中都有重要参与，这一过程对于维持睾丸组织的形态结构稳定和功能正常起到关键作用。ATG5是男性生殖细胞发育中的一种核心自噬蛋白，有实验研究[16]表明，将雄性小鼠生殖细胞中的ATG5条件性失活，然后检测自噬指标。实验结果显示睾丸自噬体标记LC3A/B-II的表达显著降低，自噬受体SQSTM1/p62的表达显著增加，这表明睾丸自噬活性降低，且雄性小鼠的生育能力急剧下降，约70%的小鼠不能生育，极大地增加了罹患男性不育症的几率。这提示自噬可保护睾丸组织，是支持细胞在应激状态下的有效保护机制。研究表明[17]，在山羊睾丸支持细胞(SC)的细胞质中发现了许多自噬体和溶酶体，它们围绕着生精小管基部隔室中的生精细胞。在较晚的阶段，SC表现出自噬体和自溶酶体，在顶体形成不同阶段的精子发生过程中，与多囊泡体(MVB)一起使用。在SC的细胞质中发现了许多包埋的细长的精子，被自噬成分和MVB包围。在透射电镜下，自噬体的平均直径为952.35 nm，自溶酶体的平均直径为504.38 nm。总的来说，这些结果表明，自噬在SC中活跃，并且随着精子发生从SC的基底腔向腔腔的发展，自噬的水平变得更加明显。在高血糖状态下，自噬在睾丸组织中是受抑制的，且精子的存活率和精子活力也受到抑制，而睾丸的支持细胞是在睾丸生精作用中发挥着重要影响。核因子E相关因子(2cnuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是诸多细胞信号道路中最重要的一种，是一种基础转承调节因子。有实验[18]表明，睾丸支持细胞在受到氧化应激刺激时会使Nrf2通路表达下降，镜下观察细胞数量明显减少，部分细胞形态不规则。而已有文献报道[19]自噬通过破坏Nrf2加剧糖尿病的睾丸氧化损伤。综合来看，研究睾丸支持细胞自噬对糖尿病引起的生殖障碍机制有新的启示。

1.2 睾丸间质(leydig)细胞

睾丸激素是重要的成年男性激素，是性发育和维持男性特征所必需的[20，21]。血清睾丸激素水平不足通常与原发性或迟发性性腺功能低下(LOH)有关[22](LOH)，这不仅与男性性功能障碍和生殖能力下降有关，而且与心血管疾病，糖尿病[23]有关。睾丸激素主要在Leydig细胞中合成，据报道该细胞自噬非常活跃[24]。最近的研究[25]表明，老年大鼠Leydig细胞的自噬活性降低，并且在大脑中具有ATG5表达的自噬缺陷型小鼠中性激素水平降低[26]。因为自噬已经通过称为大脂质的过程参与脂质代谢，从而为细胞提供甘油三酸酯(TGs)和胆固醇的来源，所以推测自噬可能通过促进Leydig细胞中的脂质代谢而参与睾丸激素的合成。为了进一步验证该假设，有实验检测到成年小鼠睾丸中LC3和脂滴(LD)的精确定位，与先前在肝细胞和巨噬细胞泡沫细胞中的发现一致[27]。根据这些研究，我们得出结论，自噬在成年小鼠Leydig细胞中极为活跃，并可能通过脂质代谢调节类固醇生成。有实验[28]证明，在链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠模型中形态学结果显示Leydig细胞中的细胞凋亡和坏死，其特征在于染色质碎裂和凝集，以及光滑的内质网减少，没有脂质滴、细胞质。由于自噬是一种细胞代谢过程，利用溶酶体降解细胞成分来提供原材料，以帮助细胞在压力条件下存活，所以在睾丸间质细胞中见到的细胞质自噬体可能是自噬活性缺陷的迹象，这与这些细胞中睾丸激素的低分泌有关。总之，这些结果证明了自噬是糖尿病患者性腺功能减退导致不育症的重要治疗方向。

2 调控自噬相关信号通路对糖尿病男性睾丸损伤发生发展的影响

糖尿病男性睾丸损伤的发生与mTOR、AMPK等通路密切相关，在细胞的营养状况发生改变的条件下(如高血糖)，可调控自噬[29]。众多证据表明，在正常和糖尿病睾丸损伤机体中，自噬均发挥着关键作用，STZ诱导的糖尿病小鼠中自噬受到抑制。因此，调控自噬相关的通路可能是一个新的方向。

2.1 mTOR通路

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。mTOR的编码主调节蛋白激酶，其主要调节细胞发育过程，如生长，增殖，代谢，分化，自噬，蛋白质合成，和细胞骨架调节[30]。各种各样的细胞内和细胞外刺激可以指导这些事件，这些事件以细胞类型特异性的方式差异发生。mTOR信号的失调已经牵涉到许多人类疾病中，包括糖尿病[31]。其中，人们强调mTOR信号通路是自噬的最主要调节剂,在自噬的诱导，过程和终止中起着复杂的作用，这给糖尿病及并发症的发病机制和防治都提出了新的观点。MTOR通过两种不同的信号传导蛋白质复合物起作用：mTORC1和mTORC2。在营养素或生长因子剥夺和低细胞能量水平下，已显示抑制mTORC1活性，诱导了自噬的发生。这表明自噬诱导和mTORC1激活紧密反向耦合，对mTORC2活性诱导自噬尚未完全了解[32]。激活mTOR会使雄性小鼠的睾丸发育缺陷，加重不育症。研究[33]表明，mTORC1激活促进小鼠精原细胞分化，但是过度激活会导致低生育力。在实验中，有条件地在小鼠体内敲除掉mTORC1抑制剂TSC1，小鼠表现出睾丸发育缺陷、部分生精停滞、生殖细胞过度损失、精子数量减少和生育力低下。也就是说，mTORC1的过度激活损害精子发生，使小鼠的生殖系统受到严重的损伤。据报道，中度自噬对高血糖[34]引起的睾丸损伤具有保护作用。而自噬异常则会导致男性不育。在各种应激和高糖条件下，信号传导途径是哺乳动物生殖细胞自噬的典型负调控途径。在糖尿病男性不育症的发病机理中，活性氧(ROS)起着至关重要的作用[35]。研究报告称，长期高血糖生物体中过度产生的ROS会显著抑制mTOR信号传导途径，从而影响细胞自噬功能，从而导致精子的变性和畸形，并影响精子的数量、运动性和附睾的功能[36，37]。近年的研究[38]表明，链脲菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠睾丸组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达降低，p62表达上调，这提示糖尿病大鼠睾丸组织的自噬被抑制。在雷帕霉素治疗之后，睾丸Beclin1、LC3表达水平显著升高，均p62表达水平显著降低，睾丸组织病理改变显著减轻。这提示雷帕霉素改善了大鼠睾丸的损伤，雷帕霉素是mTOR的抑制剂，抑制mTORC1后对糖尿病大鼠睾丸产生保护作用，提示自噬激活对睾丸具有保护作用。

自噬可能是通过mTOR通路对改善糖尿病男性生殖障碍起作用，这为临床治疗提供更多的机会。

2.2 AMPK通路

真核细胞中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在调节细胞能量平衡中起主要作用。AMPK响应于细胞内腺嘌呤核苷酸水平的变化，这相对于ATP被AMP / ADP的增加所激活。AMPK的激活增加了分解代谢(ATP生成)的速率，并降低了合成代谢(ATP利用)的速率。除维持细胞内能量平衡外，AMPK还调节全身能量代谢。鉴于其在控制能量稳态中的关键作用，AMPK作为代谢疾病(包括2型糖尿病和癌症)的潜在治疗靶标引起了广泛的关注[39]。近些年的研究结果显示，在内分泌受到干扰的情况下，如黄曲霉素B1(AFB1)体内实验显示血清睾丸激素(T)，促黄体生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的水平，减少了Leydig细胞数量并下调了水平睾丸激素生物合成相关基因的表达。体外研究表明，AFB1(10 μM)通过抑制某些T生物合成基因的表达，显着提高ROS水平，并降低Leydig细胞的T产生。此外，AFB1通过降低pAMPK/AMPK比和增加pmTOR/mTOR比，然后进一步上调自噬和凋亡蛋白LC3，Beclin 1和BAX，诱导Leydig细胞凋亡，以及下调自噬通量蛋白P62和抗凋亡蛋白BCL-2。AFB1诱导的Leydig细胞毒性是通过抑制T-生物合成基因表达，减少Leydig细胞数量，促进ROS产生以及通过抑制AMPK/mTOR介导的自噬通量途径诱导细胞凋亡来表征的[40]。慢性高血糖症和活性氧(ROS)的过量产生是糖尿病生殖并发症发展的有力预测指标，实验[41]研究结果说明糖尿病大鼠睾丸中的ROS增多，睾丸结构损伤，精子数量和活力均降低。综上所述，提示研究药物可以通过上调pAMPK/AMPK比例这一角度，来进一步下调自噬，从而对大鼠睾丸起到保护作用。

3 结语

近年来，为寻找防治糖尿病不育症的方法，越来越多的研究涉及到糖尿病不育发生发展的分子机制。自噬作为一种机体的自我保护机制，在糖尿病睾丸损伤的发生发展过程中所发挥的重要作用被越来越多的研究所证实。但是自噬究竟通过怎样的方式，起着怎样的作用，目前尚未取得一致的意见，想要找到治疗疾病的新靶点依旧需要更多的理论和实验支持。