绿原酸对猪精液冷冻保存效果的影响

何 涛,李青旺,余四九

(1．甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070；2．宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；3.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100)

动物精液冷冻保存技术使优秀种质资源的传播与保存不受限制，对一些特色濒危种质资源的保护利用具有积极意义。在生产实践中，与引进活体种公畜相比，经营者可更方便、更廉价地选择世界最优质的种质资源，进行人工授精与品种改良，提高生产效益，降低生产成本和患传染病风险。精液冷冻和人工授精技术在奶牛、肉牛等大家畜中得到了广泛的推广应用，因猪精液冷冻保存的研究和应用相对滞后，目前仍采用鲜精或者常温、低温短暂保存后的鲜精配种，严重限制了优良品种资源的推广[1-2]。

精子细胞在冷冻过程中会产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，过量的ROS可以和不饱和脂肪酸产生过氧化反应，破坏精子细胞膜，因猪精子质膜含有较多的不饱和脂肪酸，使猪精子在冷冻保存过程中易发生脂质过氧化反应产生过量活性氧造成其质膜完整性和通透性遭到破坏，易形成低温打击，导致解冻后的精子存活率低、人工授精繁殖率不高，从而限制了猪精液冷冻保存技术的广泛推广应用。研究表明，在稀释液中加入外源性或内源性抗氧化剂或者新型抗氧化剂能有效保护猪精子在保存过程受氧化损伤，保护精子并提高其活力[3-4]。黄俻华等[5]研究发现，冷冻稀释液中添加600μg/m L的维生素C或E可以显著提高陆川猪精液冷冻保存效果。黄明光等[6]研究发现，冷冻稀释液中添加0.04%浓度的茶多酚可以显著提高猪精液的冻后质量。王捷等[7]研究发现，在猪精液冷冻稀释液中添加 0.2 g/L芝麻酚可以显著提高解冻后猪精子活率、SOD、CAT和GSH-Px活性。但保护效果有限，不能在生产实践中直接应用，所以探寻一种新型抗氧化剂依然是猪精液冷冻保存的热点研究课题。

绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)是普遍存在于植物体的一种苯丙素类化合物[8]，具有抗氧化、清除活性氧自由基、抗辐射和消炎抗菌等多重作用[9-11]。研究表明，绿原酸在常温和冷藏等条件下具有改善猪精子的存活率，提高精子线粒体活性和顶体完整率，增强其抗氧化活性，提高精液保存品质等作用[12-13]。但在冷冻条件下，有关绿原酸对猪精子保存效果的相关研究甚少。本文旨在通过在TCG稀释液中添加不同浓度的绿原酸，测定冷冻-解冻后精子相关质量和抗氧化指标，来研究绿原酸对猪精液冷冻保存的效果，并筛选最佳添加量，为指导生产实践和提高优良种猪利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

随机选取陕西省杨凌某种猪场健康青年(18～30月龄)杜洛克种公猪(n=6)，手握法采集精液，室内显微镜下常规检查，选择色泽乳白、无异味、活力较好(0.7以上)的精液作为试验原材料，并在 1 h内将精液送回实验室进行处理。

1.2 试验仪器与试剂

液氮罐(成都金凤)、倒置荧光相差显微镜(日本 Nikon)、移液枪(德国 Eppendorf)、冻精细管 0.25 mL(法国 IMV)、电子分析天平(上海精密科学)、降温控制器(澳大利亚 Gryologic)、绿原酸(Sigma)、异硫氰荧光素酶标记的花生凝集素(Sigma)、吖啶橙(Sigma)、二水柠檬酸三钠(国药集团)、EDTA(国药集团)、碳酸氢钠(国药集团)、TRIS(西安国安生物)、葡萄糖(Sigma)、丙三醇(Sigma)、青霉素钠/硫酸链霉素(华北制药)、SOD、CAT和GSH-Px试剂盒(南京建成生物)。

1.3 精液的预处理与稀释

1.3.1 稀释液配制 准确称量葡萄糖 3.7 g，二水柠檬酸三钠 0.6 g，EDTA 0.125 g，碳酸氢钠 0.125 g，氯化钾 0.008 g，青霉素钠 0.06 g，硫酸链霉素 0.1 g，加双蒸水至 100 mL，调节pH至7.28，渗透压 310 mOsm/L配制成基础稀释液(BTS)；准确称量葡萄糖 1.1 g，柠檬酸 1.48 g，Tris 2.42 g，青霉素钠 0.06 g，硫酸链霉素 0.1 g，加双蒸水至 100 mL，调节pH至6.21，渗透压 286 mOsm/L配制成Tris-柠檬酸-葡萄糖(TCG)液；按77%的TCG液，19.4%的无菌鲜鸡蛋卵黄液和3.6%的丙三醇配制成冷冻稀释液。

1.3.2 精液的预处理 将初选合格的精液加入提前配制好的等量BTS液稀释，用纱布包裹装入保温瓶中(33 ℃左右)尽快带回实验室，在室温下静置1 h，期间需要轻轻晃动精液3次，使精液与BTS液稀释完全混匀平衡。然后分装到 10 mL离心管中以1 000 r/min速率离心 10 min，弃上清待用。

1.3.3 精液的稀释 首先取离心后待用的精液按1∶2比例加入等温冷冻稀释液并迅速用手旋转混匀，静置 10 min后加入不同浓度的绿原酸；然后再将稀释静置后加有不同浓度绿原酸的液体按1∶1比例加入等温冷冻稀释液并迅速用手旋转混匀，稀释后需继续用纱布包裹，然后置4 ℃冰箱平衡 1.5～2 h。检查选择精子活力在0.6以上的稀释精液进行装管冷冻。

1.4 精液的冷冻和解冻

1.4.1 精液冷冻 将封装标记好的精液细管放入程序冷冻仪中控制其以1 ℃/min的速率从4 ℃降至-5 ℃，当温度恒定在-5 ℃时，从程序冷冻仪中迅速取出细管，快速放到冷冻槽上，使其在距液氮面 3 cm处熏蒸 10 min，最后将细管迅速投到液氮中保存。

1.4.2 精液解冻 细管冻精须在液氮中保存10 d以上、冷冻状态稳定后再解冻。解冻时37 ℃水浴45 s即可，取出后剪断两端，将精液滴入 1.5 mL离心管，再水浴 10 min后用于各项指标检测。

1.5 精子的质量检测

1.5.1 精子活率的检测 解冻孵育好的精液样品，400×倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活率。

1.5.2 精子质膜完整性检测 利用低渗肿胀试验(Hypo-osmotic Swelling Test，HOST)测定并计数，重复3次，每次计数精子不少于200个。按“精子质膜完整率=弯尾精子数/计数总精子数×100%”公式计算。

1.5.3 精子顶体完整性检测 利用异硫氰荧光素标记的花生凝集素法(FITC-PNA)对精子顶体进行特异性染色观测计数，重复3次，每次计数精子不少于200个。按“精子顶体完整率=顶体完整精子数/计数精子总数×100%”公式计算。

1.5.4 精子DNA完整率检测 利用吖啶橙染色法(AOT)对精子进行特异性染色观测计数，重复3次，每次计数精子不少于200个。按“精子DNA完整率=绿色荧光精子数/计数精子总数×100%”公式计算。

1.5.5 精子SOD活性检测 按试剂盒说明操作并统计结果。

1.5.6 精子CAT活性检测按试剂盒说明操作并统计结果。

1.5.7 精子GSH-Px活性检测按试剂盒说明操作并统计结果。

1.6 数据处理

应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，数据用平均数±标准差表示(mean values±S.E.M.)，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 绿原酸对冻后猪精子活率和功能完整性的影响

从表1可知，添加量为 15～50 μg/mL范围时，冻后精子的活率和功能完整性指标数与添加量的呈正相关，其中添加量为 50 μg/mL时，精子活率、顶体完整率、质膜完整率、DNA完整率最高(P<0.05)。当添加剂量为 30 μg/mL时，冻后精子活率、质膜完整率和DNA完整率参数较对照组差异显著(P<0.05)，精子顶体完整率参数较对照组差异均不显著(P>0.05)。

表1 添加不同浓度绿原酸对猪精子活率和功能完整性的影响Table 1 The effects of chlorogenic acid on boar sperm motility and functional integrity

2.2 绿原酸对冻后猪精子抗氧化酶活性的影响

从表2试验结果可以看出，添加绿原酸对猪精子冻后精子抗氧化物酶活性均有提高作用(P<0.05)。绿原酸添加量从 30 μg/mL到 100 μg/mL，精子SOD、CAT、GSH-Px活性均有提升(P<0.05)，其中添加量为 50 μg/mL时精子SOD、CAT、GSH-Px活性最高。当添加剂量为 15 μg/mL时，精子的SOD活性较对照组差异显著(P<0.05)，CAT、GSH-Px活性较对照组差异不显著(P>0.05)。

表2 添加不同浓度绿原酸对猪精子抗氧化酶活性的影响Table 2 The effects of chlorogenic acid on boar sperm antioxidant enzyme activity

图1 相差显微镜下猪精子HOST检测(200×).质膜完整精子；.质膜损伤精子Fig.1 HOST test (200×) of swine sperm under phase contrast microscope .sperm with intact plasma membrane；.sperm with impaired plasma membrane

图2 荧光倒置显微镜下检测猪精子FITC-PNA染色(400×).顶体完整精子；.顶体损伤精子Fig.1 Detection of FITC-PNA staining (400×)of swine sperm under fluorescence inverted microscope .sperm with intact acrosome；.sperm with impaired acrosome

3 讨 论

本试验结果显示，猪精液冷冻稀释液中添加适量绿原酸后冷冻精子活率、顶体完整率、质膜完整率、DNA完整率、SOD、CAT和GSH-Px活性等指标均有所提高，特别是添加 50 μg/mL时效果最佳，表明绿原酸对猪精液冷冻保存有一定保护作用。该结果同Namula等[14]在精子冷冻过程中添加 100 μmol/L绿原酸可改善精子活力和细胞膜完整性，提高精液保存效果的研究结果相一致。

绿原酸可能通过多方面的作用提高精子在不同条件下的保存效果。在抗氧化损伤保护方面，由于精子的质膜和细胞质富含多不饱和脂肪酸，猪精子对低温相对比较敏感，冷冻过程中精子获能和运动时容易发生线粒体功能障碍，引起供能(ATP)不足。另外线粒体生成过量的ROS，与精子质膜和细胞质中的不饱和脂肪酸产生过氧化反应导致膜损伤，使精子功能改变，造成精液品质下降[15]。绿原酸作为多酚类化合物，其分子中含有5个活性羟基和1个羧基，能提供氢自由基来有效消除活性氧和羟基自由基，从而避免发生氧化反应，有效减少精子的氧化损伤，维持精子结构和功能完整性[16]；另一方面绿原酸的抗氧化性可能通过清除氢、氧自由基和调节糖代谢来实现[17]。精液中SOD、CAT和GSH-Px酶活性可直接反映其抗氧化能力，其活性越高说明其抗氧化性越强。添加绿原酸后精子抗氧化酶的活性都显著提升，这说明抗氧化能力的升高是潜在的作用途径之一。这也可以通过Feng等[18]和Boettler等[19]分别发现绿原酸通过谷胱甘肽等途径上调抗氧化酶活性的研究结果得以体现。

在抗低温打击方面，由于猪精液在冷冻保存过程中，比其他家畜更容易受低温打击发生冷休克和因温度的改变而形成的细胞内冰晶会损伤细胞膜、线粒体和核结构，进而造成细胞不可逆的损伤，主要表现在解冻后精子活力降低或丧失，顶体膜受损，DNA完整率下降等，一般精子在低温或冷冻保存时加入一定的抗冻保护剂，如渗透性冷冻保护剂甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等以及非渗透性冷冻保护剂卵黄和糖类等来减少冷应激对精子造成的损伤[20]。本试验在猪精液冷冻保存时加入绿原酸，可能减少了细胞内外溶液形成的大个体冰晶，促使精子能够安全通过冰晶化危险温度区，降低低温对精子细胞膜、顶体的破坏，从而显著的提高精子活率、顶体完整率、质膜完整率，减少了低温对精子的物理损伤，这说明抗低温打击能力的提高是潜在的作用途径之一。这同Ros-Santaella等[21]在猪精液保存过程中添加含有绿原酸的龙须草提取物等方法提高精子的直线运动率和细胞膜完整率的研究研究结果一致。

本试验中绿原酸对精子的冷冻保护效果，并没随着添加剂量的增加而逐渐增强，添加量达到 100 μg/mL时，冻后精子各项检测指标反而均有所下降，特别是活率下降明显，这可能与过量添加绿原酸会降低精液样品pH和冷冻稀释液的渗透性有关[22]。pH过低影响琥珀酰辅酶A、乙酰辅酶A等代谢酶的酰化作用，降低这些酶介导的能量代谢，使精子的代谢能力和运动性能逐渐减弱影响ATP水平，降低精子活性剂保存效果。新鲜猪精液的渗透压为 290～300 mOsm，pH约为7.2～7.5[23]，当精液pH降低至6.2时，两天后精子质膜完整性和保存活率均出现显著的降低[24]，pH为6.5～6.9时常温保存的效果最好[25]，所以当精液渗透压超过一定范围，精子会出现脱水、肿胀等现象发生不同程度的损伤，降低精液的品质。在本研究中，50 μg/mL绿原酸添加对冷冻精子的保护效果最佳，可能同该添加浓度下精液pH和渗透压最适宜相关，也说明研究其他精液冷冻保护剂时需要仔细考虑不同剂量对上述因素的影响。

4 结 论

猪精液冷冻稀释液中添加绿原酸可通过提高冻后精子活率、顶体完整率、质膜完整率、DNA完整率、SOD、CAT和GSH-Px活性等来起到保护作用，最适添加量为 50 μg/mL。