固相萃取-高效液相色谱法同时测定蔬菜中氯虫苯甲酰胺等5种农药残留量

吴丹亚，潘洁

(宁波市农业技术推广总站，浙江 宁波 315012)

氯虫苯甲酰胺是从邻氨基苯甲二酰胺类化合物中筛选出来的具有新型结构的广谱型杀虫剂[1]，近年在生产中得到广泛应用。吡虫啉、多菌灵、除虫脲与灭幼脲也是在粮食、蔬菜与果树生产上普遍使用的低毒性农药。农药使用带来的农产品中的农药残留问题一直是人们关注的热点。GB 26763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对不同食品基体中的这5种农药的残留量均设定了限量标准。除氯虫苯甲酰胺外，其他4种农药的残留测定国家标准和行业标准中都有涉及，但液相色谱法都是针对单个农药的测定，尚无同时检测的标准。目前对氯虫苯甲酰胺的测定和多农药残留测定，大都采用液相色谱—串联质谱法[2-5]。本文结合已有的方法，利用现有的试验条件，建立了一种乙腈提取、氨基小柱固体萃取、液相色谱-紫外检测器检测蔬菜中这5种农药残留的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

供试蔬菜样品为大白菜与番茄；供试药剂吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲与灭幼脲均为标准品，浓度均为100 μg·mL-1(农业农村部环境保护科研监测所)；甲醇、乙腈(默克，HPLC级)，氯化钠(国药，分析纯)，二氯甲烷(国药，分析纯)，试验用水为屈臣氏纯净水。

1.1.2 仪器

Dionex U3000液相色谱仪(热电公司，配紫外检测器)，Dionex Acclaim 120 C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；氮吹仪(Organomation E-EVAP 112)，数显恒温水浴锅(HH-6，国华)，高速分散均质机(IKA T18)，离心机(SIGMA 4-16)，Agela Cleanert NH2小柱(500 mg/6 mL)。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

提取。在25.0 g蔬菜样品(大白菜、番茄)中加入50 mL乙腈，高速匀浆2 min后，加入7～8 g氯化钠，继续高速匀浆2 min，3 000转·min-1离心5 min。吸取上清液10 mL，放入50 mL烧杯中，于70 ℃水浴锅上蒸发至近干，加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)，盖上铝箔，待净化。

净化。将NH2柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)混合液充分活化，当溶剂液面到达吸附层表面时，立即加入上述待净化溶液，用5 mL具塞刻度试管收集洗脱液，用2 mL甲醇+二氯甲烷(1+99)洗烧杯后过柱，并重复1次。将具塞刻度试管置于氮吹仪上，水浴40 ℃，氮吹蒸发至近干，用甲醇准确定容至2.5 mL。旋涡混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.2 色谱条件优化

柱温30 ℃，进样量10 μL。针对波长、流动相及流速等方面进行优化，以200～400 nm范围内的波长扫描结果确定检测波长；选择甲醇+水、甲醇+乙腈+水2种流动相，进行洗脱，根据色谱结果来确定最佳色谱条件。

1.2.3 标准曲线绘制

准确吸取0.8 mL吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲、灭幼脲标准品，用甲醇定容至10 mL，配成8 μg·mL-1的单一标准储备液。准确吸取50、100、150、200、250 μL标准储备液，分别定容至10 mL，配成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg·mL-1混合标准工作液。按最佳色谱条件进行测定，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 波长选择

对5种农药在200～300 nm进行光谱扫描，结果表明，吡虫啉最大吸收波长为270 nm，多菌灵在286 nm附近有较大吸收，除虫脲与灭幼脲在254 nm处有较大吸收，氯虫苯甲酰胺在210～300 nm无明显吸收峰，且随着波长的增加吸收减弱(图1)。鉴于254 nm干扰相对较大，而在270 nm处5种农药都有较大的吸收，因而选择270 nm作为检测波长。

图1 5种农药紫外光谱扫描曲线

2.2 流动相选择

首先考虑常用的甲醇+水系统，但试验结果表明，甲醇+水系统在峰型、分离度上不是十分理想，当加入乙腈之后，采用梯度洗脱，充分利用乙腈与甲醇在分离选择性上的差异，明显改善了峰型、提高了分离度，达到比较理想的分离效果。

2.3 流速选择

流速大虽能缩短分析时间，但会影响分离效果；流速过小则会使分析时间变长并影响峰型；因而从分析时间、分离情况与峰型等方面综合考虑，1 mL·min-1的流速能达到较满意的结果。由此确定最佳的色谱条件：柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长270 nm，流速为1 mL·min-1，流动相为水+甲醇+乙腈，采用梯度洗脱，具体见表1。保留时间定性，外标法定量。5种农药的标准溶液色谱图见图2，供试大白菜与番茄的色谱图见图3～5。

表1 流动相梯度洗脱程序

图2 5种农药混合标准液色谱(0.2 μg·mL-1)

图3 大白菜样品色谱

图4 番茄样品色谱图1

图5 番茄样品色谱图2

2.4 标准曲线线性范围及最低检出限

在最佳色谱条件下，对系列浓度的混合工作液进行测定，确定其回归方程与相关系数。从表2可知，5种农药在40～200 μg·L-1范围内，线性良好，相关系数都大于0.999，符合农残分析要求[6]。计算40 μg·L-1标准溶液中各农药的的信噪比，以其3倍信噪比来确定各农药的最低检出限。

表2 5种农药的标准曲线

2.5 回收率与精密度

对大白菜与番茄样品进行回收率试验。在蔬菜样品中分别添加2个浓度水平的农药标准溶液，按上述方法进行样品处理与测定，每处理6个平行。

对大白菜样品，当添加量为0.05 mg·kg-1时，吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲与灭幼脲的平均回收率分别为100.8%、108.6%、82.5%、109.8%、91.6%；当大白菜中添加量为0.2 mg·kg-1时，吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲与灭幼脲的平均回收率分别为104.1%、104.8%、98.2%、105.7%、103.5%。对番茄样品，当添加量为0.05 mg·kg-1时，吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲与灭幼脲的平均回收率分别为74.3%、108.4%、94.5%、90.6%、98.2%；在番茄中添加0.2 mg·kg-1时，吡虫啉、多菌灵、氯虫苯甲酰胺、除虫脲与灭幼脲的平均回收率分别为90.4%、88.1%、101.7%、101.3%、102.9%。(具体见表3)。大白菜与番茄回收率试验中，回收率及相对标准偏差符合农药残留分析要求。

表3 大白菜和番茄中5种农药的回收率和变异系数

3 小结

采用乙腈提取、氯化钠盐析、NH2小柱净化，建立了蔬菜中氯虫苯甲酰胺等5种农药的残留液相色谱检测方法，并在大白菜与番茄上进行了验证，其中大白菜的加标平均回收率为82.5%～109.8%，相对标准偏差为1.0%～12.4%，番茄的加标平均回收率为74.3%～108.4%，相对标准偏差为1.3%～12.2%，其结果符合农药残留检测分析要求。