甲状腺乳头状癌自噬相关蛋白LC3与Beclin1及其调控基因的表达与分析*

陈兴 郑俊杰 张爱龙 游振辉

迄今为止，甲状腺癌仍是目前临床发病率最高的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占总人口的1%[1]，且有逐年增长之趋势[2]，其增速之快应得到临床工作者的足够重视。甲状腺癌表现为几种常见的亚型，包括甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、滤泡癌（follicular carcinoma，FC）、髓样癌（medullary carcinoma，MC）、低分化癌（poorly differentiated carcinoma，PDC）和间变性癌（anaplastic carcinoma，AC），且临床表现与预后各不相同，其中，PTC 亚型最为常见，占比可达85%～90%[3]。尽管PTC恶性度较低、发展缓慢、预后较好，但是仍有10%左右的患者在治疗后期出现复发、侵袭的情况，且大概率发生淋巴结转移，转移率可达15%～50%；此外，淋巴结隐匿性转移甚至高达70%～80%，极大程度影响了患者的无病生存期和死亡率[3-4]。因此，深入了解PTC 病因及发病机制显得尤为重要。近年来，依托越来越完善的分子生物学技术，更多学者将组织病理结合分子生物学技术应用到PTC 研究领域。在肿瘤研究领域，自噬被认为是细胞溶酶体的降解，其在PTC 发生过程中的角色受到广泛关注。目前认为自噬在肿瘤发生的起始阶段，自噬可抑制肿瘤发生，但随着体内肿瘤的发展，自噬在肿瘤发生、发展过程中可能扮演者双重调节的作用[5]。

Beclin1 是调节细胞自噬现象的关键蛋白，同时也是细胞启动自噬的标志[6]。人类微管相关蛋白轻链3（LC3）是编码自噬相关蛋白的关键基因，参与了哺乳动物自噬形成中的泛素样蛋白加工修饰过程，在细胞内以LC3-I 及LC3-Ⅱ两种形式存在，并可通过检测细胞内的LC3 及其向LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的转化以判断细胞自噬是被诱导还是被抑制[7-9]。现已知在人类LC3 蛋白有3 种亚型（LC3A、LC3B和LC3C），韩国学者Kim 等[1]研究表明，LC3 的两个亚型LC3A 和LC3B 在不同病理类型的甲状腺癌中的表达有所差异。鉴于此，为明确自噬相关蛋白LC3 与Beclin1 及其调控基因LC3A、LC3-B 和BECN1 在PTC 患者中发挥的作用及对患者预后的影响，本研究对20 例PTC 患者术后新鲜组织标本和20 例甲状腺良性病变切除的正常甲状腺新鲜组织标本进行了LC3 与Beclin1 及其调控基因表达情况的研究分析，探讨细胞自噬在甲状腺乳头状癌形成中的作用，旨在为PTC 患者的早期诊断提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析本院2018年12月-2019年12 月确诊并行手术切除的PTC 患者20 例，同期因甲状腺良性病变就诊的患者20 例。纳入标准：入组患者均为初诊患者；患者临床资料完整，术前未进行放疗、化疗、同位素治疗及内分泌治疗。排除标准：收住院期间询问病史，术前合并其他肿瘤；二次或以上手术及复发；术后诊断为PTC 合并甲状腺其他类亚型癌。入组患者（PTC 组和良性病变组）术中留取两块黄豆粒大小的新鲜组织，分别用于RT-PCR 检测和Western Blot 检测。所有用于科学研究的标本均置于-80 ℃冰箱中保存备用。本研究经过福建省立医院伦理委员会审批，入组患者已被告知本研究内容并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 分别取前期保存的PTC 组织和良性病变甲状腺组织各50 mg，加入1 mLTrizol 试剂冰上研磨，待测组织总RNA 的提取参照试剂盒说明书进行。抽提结束后，核酸浓度测定仪（260 nm）测定总RNA 浓度与纯度，OD260/OD280=1.8～2.0，以确保RNA 达到可靠纯度，同时电泳检测RNA 的完整度。分别参考cDNA 第一链合成试剂盒（逆转录试剂盒）说明书及KAPA™SYBR®rapid quantitative PCR Kit 试剂盒操作步骤开展检测。扩增体系：包括2 μL cDNA，0.5 U/mL TaqDNA 聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×PCR Buffer（含0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 值8.3），1.5 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 目的基因引物，最后加ddH2O 至25.0 μL。反应体系：94 ℃ 5 min-94 ℃ 30 s-55 ℃ 30 s-72 ℃60 s，35 个循环后，72 ℃延伸10 min。目的基因及内参基因正、反向引物序列见表1，采用BIO-RAD Connect 荧光定量PCR 仪器进行数据分析。

表1 目的基因及内参基因正、反向引物序列

1.2.2 Western Blot 检测 分别取前期保存的PTC组织和良性病变甲状腺组织各约100 mg，用配制好的RIPA 裂解缓冲液制备蛋白裂解物，加入5 倍体积的裂解液于冰上充分研磨4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清液重复上述步骤，再次离心取上清液，上清液经蛋白定量后，取60 μg 蛋白经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭2 h，一抗1∶1 000 孵育4 ℃过夜，用TTBS 充分洗膜后，加入二抗1∶4 000 室温孵育1 h，TTBS 清洗显色液显色后，用扫描仪进行灰度扫描，照相经自动图像分析系统进行分析。

1.3 统计学处理 使用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料以（±s）表示，比较采用独立样本t 检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 PTC 组中男6 例，女14 例，平均年龄（42.3±5.2）岁；良性病变组中男5 例，女15 例，平均年龄（41.3±5.3）岁。两组年龄、性别比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 RT-PCR 结果 RNA 抽提结束后，核酸浓度测定仪（260 nm）测定总RNA 浓度与纯度均符合实验要求，同时凝胶电泳显示较好的RNA 完整性，见图1A。RT-PCR 结果显示，与良性病变甲状腺组相比，PTC 组LC3B 基因mRNA 的相对表达（9.44±1.75）较良性组（2.09±0.37）显著上 升（P=0.026 8），LC3A 基 因mRNA 的相对表达量（1.39±0.24）较良性组（1.32±0.46）略上调（P=0.792），BECN1 基 因mRNA 的相对表达量（1.20±0.25）较良性组（1.29±0.52）稍有降低（P=0.750）。见图1B。

图1 RT-PCR结果

2.3 两组Beclin1 蛋白表达情况比较 Western Blot检测结果显示，恶性组Beclin1 蛋白表达（2.27±0.35）与良性组（1.96±0.16）比较，差异无统计学意义（P=0.059 5）。见图2。

2.4 两组中LC3A 和LC3B 蛋白表达情况比较 Western Blot 检测结果显示，恶性组LC3A 蛋白表达情况（0.76±0.02）与良性组（0.74±0.02）比较，差异无统计学意义（P=0.0604），LC3B 蛋白表达显著性增强（0.79±0.16） vs （0.25±0.01）（P=0.000），LC3B/LC3A 比值显著升高（1.04±0.02）vs （0.33±0.01）（P=0.000）。见图3。

图2 Beclin1蛋白相对表达量

图3 LC3A和LC3B蛋白相对表达量

3 讨论

PTC 是最常见的甲状腺恶性肿瘤，可于任何年龄阶段发病，甚至在某些地区已成为发病率最高的恶性肿瘤[10]，但其恶性程度低，加上全民健康意识的提升，PTC 患者的10 生存率能高达90%以上[11]。然而，PTC 较高的侵袭性却也导致患者病死率逐年增加。因此，需要在PTC 发生初期进行特异性高的早期筛查和针对性治疗，确保在PTC 发生后患者均能得到有效治疗和预防复发举措，而寻找到PTC 相关的特异性分子标记物可有效地解决这一问题，为PTC 的诊断和治疗提供新的理论依据。

细胞自噬是一种高度保守的生物行为，它可以对体内的大分子物质及细胞产生的内源性物质通过溶酶体途径进行降解，是维持细胞平衡、内环境稳定以及基因稳定性必不可少的代谢过程[12-14]。细胞自噬作为3 种细胞程序性死亡方式之一，在形态学表型上具有一定的特点：自噬发生过程中，胞质中出现大量的自噬泡，其内包裹着胞质成分和细胞器，并与溶酶体融合后再降解。有研究表明，在自噬相关基因LC3 和BECN1 的调控下，人体内环境可利用自噬强弱影响肿瘤的发生、发展及预后[15-18]。Beclin1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同源类似物，是第一个被鉴定的自噬基因，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，Beclin1 基因通过调节自噬强弱进而对肿瘤的发生、发展起重要作用。LC3-Ⅱ作为自噬活动的特异性标志物，参与自噬的延伸并促进自噬体的形成，其表达水平的高低反映了自噬水平的高低[19]。在乳腺癌、大肠癌、肺癌、卵巢肿瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤中均存在自噬活性失常现象[20-25]。同时，自噬在恶性肿瘤的发生、发展中可能起双重作用，在不同器官肿瘤或同一器官不同类别肿瘤，甚至同一肿瘤的不同发展阶段中的表达情况可能都会呈现出一定的差异性。陈小林等[15]研究表明，Beclin1 和LC3 在甲状腺癌组织中呈低表达，导致表达降低的组织细胞的自噬能力降低，细胞生长周期增加，从而间接造成了胞增值能力和转移能力的增强，为肿瘤的形成提供有利条件。然而，孙芳红等[12]研究显示，在大多数癌旁的甲状腺组织细胞中LC3 呈低水平表达，而在甲状腺乳头状癌组织中呈强阳性表达。而在本研究中，相比于良性病变甲状腺组织，恶性PTC 组织中Beclin1 蛋白上调表达，提示PTC 组织中细胞自噬活性增强，但未达到显著性差异（P＞0.05）。考虑到LC3 蛋白受LC3A和LC3B 两个基因的双重调节，目前研究显示LC3B基因显著上调表达（P＜0.05），LC3A 基因略微上调表达（P＞0.05），为此，本课题组分别研究LC3A 和LC3B 在PTC 和良性病变甲状腺组织中的表达情况，结果显示PTC 组和良性组LC3A 蛋白表达无显著性差异（P＞0.05），而LC3B 蛋白表达具有显著性差异，LC3B/LC3A 比值亦显著升高（P＜0.05），提示PTC组织中细胞自噬活性显著增强。目前与PTC 相关的LC3A 和LC3B 的研究相对较少，在开展PTC发生、发展与自噬蛋白相关性研究时，应综合考虑LC3 及其亚型蛋白LC3A 和LC3B 在肿瘤组织中表达情况及其与临床病理参数的关系。

综上所述，LC3B 亚型蛋白可能是PTC 患者的一个潜在靶点，在后期研究中应考虑大样本验证，以明确LC3B 蛋白作为判断甲状腺良恶性肿瘤的生物标记物的可行性；同时，应结合免疫组织化学技术，综合判断LC3A、LC3B 蛋白强度以及LC3B/LC3A 比值与其他临床病理参数的关系。