循环游离DNA在乳腺癌中的应用及进展

舒准，周炳娟，张金库，韩宇星

(1.承德医学院研究生学院，河北 承德 067000；2.保定市第一中心医院病理科，河北 保定 071000)

0 引言

乳腺癌(BC)是世界第二大流行疾病，仅次于肺癌，仅2018年新增约210万例。它也是女性中最常见的癌症和第二大死因，占所有癌症的25.1%[1-3]。从21世纪初，乳腺癌流行已被认为是特有的新趋势。由于其性质的复杂性，乳腺癌有效的治疗可能会遇到许多挑战。虽然根治手术、放射治疗和药物治疗大大降低了乳腺癌患者复发的风险，提高了患者的总存活率，但仍有一定比例的患者出现早期肿瘤复发或进展[4,5]。

乳腺癌通常根据肿瘤的分子结构分为不同的亚型[6]。乳腺癌的一种亚型是雌激素受体阳性(ER+)/孕激素受体阳性(PR+)，通常被认为是一种对内分泌治疗有反应的肿瘤[7,8]。第二个亚型是HER2+阳性的人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor positive，HER2+)乳腺肿瘤，以HER2癌基因过表达为特征，可以使用曲妥珠单抗进行治疗。三阴性肿瘤是乳腺癌的另一种亚型，肿瘤内缺乏ER、PR和HER2的阳性表达。这种亚型死亡率很高，并且对某些药物治疗方法没有反应[9]。除个体间多样性外，乳腺肿瘤具有较高的瘤内异质性，在治疗选择中起着重要作用[10]。因此，解决乳腺肿瘤异质性的理想方法是找到一种能够捕获肿瘤整个遗传图谱的方法。收集肿瘤的连续活检和纵向监测是捕获肿瘤系统发育进展的必要条件。然而，仅仅通过组织活检来做这些手术是不可行的，因为它们是侵入性的，可能是不全面的。使用新开发的液体活检方法可以彻底地筛查乳腺癌的不同分子结构[11,12]。分析液体活检的高灵敏度技术使得肿瘤患者的连续活检成为可能[13]。此外，这种新方法解决了肿瘤内部的异质性问题，并弥补了目前采用的方法如组织活检的缺点。

1 cfdna来源及特征

循环游离DNA(cfDNA)是1948年由Mandel和Metais[14]首次发现的在血浆、血清和细胞外其他体液中循环的核酸片段。1977年Leon等[15]在乳腺癌患者的血清中检测到不同浓度的cfDNA(从0到2μg/mL)。Duque-Afonso等人发现大多数cfDNA片段的范围在80bp到200bp之间[16]，通常以一种蛋白复合体的形式存在的DNA双链片段。健康人中，cfdna主要来自于凋亡和坏死细胞，除此之外，健康细胞也可能主动释放DNA片段[17]。cfDNA可以来自不同的地方，包括健康的组织，癌症组织以及胎儿。在一些身体机能发生变化，如癌症、炎症、自身免疫性疾病、吸烟、怀孕甚至剧烈运动，以及放射或手术治疗等等，都可以引起血液中cfDNA浓度的变化[18-22]。在血液中，cfDNA浓度可能从健康人的13ng/mL到癌症晚期的大约180ng/mL不等。一般而言，cfDNA在细胞的日常功能中表现出来，例如在外泌体中的排泄和运输，或者在凋亡和坏死期间。可以在任何体液(血液、唾液、泪液、尿液、汗液、羊水、脑脊液和胸水、宫颈阴道分泌物和伤口渗出物等)中可以检测到cfDNA，并且可以在体外进行分析感兴趣的目标特征[23]。cfDNA在健康患者中存活16分钟至2.5小时，其浓度在健康患者中由于活性核酸降解而显著低于恶性肿瘤患者。这就意味着，通过cfDNA浓度的变化可以对一些癌症进行诊断和监测。但是，cfDNA的半衰期很短，不到2小时，可以通过肝脏和肾脏清除[24]。肾功能不全会影响cfDNA清除率，这可能是调节某些癌症患者cfDNA浓度的一个混杂因素。cfDNA检测是一种在分子水平上检测肿瘤的新方法，具有广阔的应用前景。

2 cfdna临床应用

cfDNA分析提供了检测微小残留病和监测复发的机会，这可能有助于改善患者的管理和预后。Tie等人报道称，cfDNA分析可能有助于检测最小的残留病，这表明基于突变cfDNA的检测，有能力选择癌症患者进行辅助治疗[25]。Openshaw等人通过跟踪肿瘤组织和胃食管腺癌患者相应血浆样本中的TP53突变频率，研究了突变的cfDNA跟踪肿瘤进展和提供微小残留病证据的能力[26]。Phallen等人的另一项研究。使用大规模平行测序来识别体细胞突变，作为大肠癌(CRC)患者的突变cfDNA标记物，用于检测微小残留病，并监测三年随访期内肿瘤负担的变化。在所有复发患者中都检测到突变的cfDNA，但在未复发患者中未检测到[27]。林等人评估了灵敏的54个癌症基因数字NGS分析在黑色素瘤根治性手术切除后区域转移患者中的应用，该分析覆盖了所有主要的黑色素瘤驱动基因[28]。在胃癌(GC)患者的血浆中，Ogino等人发现，ddPCR测定的HER2比率是检测复发和实时评估HER2状态以监测HER2阳性胃癌患者治疗效果的一种可重复的非侵入性方法[29]。

治疗和耐药性监测显然也是肿瘤学的一个挑战。自从L.Diaz和Bardelli的小组以前的开创性工作[30-32]证明肿瘤中出现耐药克隆导致靶向治疗耐药以来，cfDNA分析也成为检测治疗过程中早期耐药的潜在工具。

3 cfdna与乳腺癌

乳腺癌的早期诊断是降低癌症相关死亡率的关键，但其重要性因疾病类型和级别的不同而不同。对于II级和III级乳腺癌，进展要比I级癌症快得多。早期乳腺癌是可以被治愈的，因此，如果在肿瘤在小于2厘米的情况下早期诊断，这些患者的总体生存和预后可以得到极大的改善，但是这种在患者未出现症状时，对其进行检测时具有挑战性的[33]。乳腺癌的早期检测也有助于选择适当的治疗方法和辅助治疗，因此增加了解决的机会。多项研究已经检验了循环游离DNA在乳腺癌症状前早期检测的可能性[34-36]。Beaver等人的一项研究报道了使用ddPCR准确检测到PIK3CA基因的突变[36]，他们发现15名患者的肿瘤中存在PIK3CA突变，其中14例是在匹配的术前cfDNA中检测到的。术后对14例患者中的10例进行了cfDNA检测，其中5例(50%)术后仍可检测到PIK3CA突变。由此可见，在早期乳腺癌患者中，可以使用ddPCR在手术前后检测到cfDNA。同时，对于接受过肿瘤切除手术的癌症患者。液体活检可用于这些患者术后的cfDNA分析，以搜索微小残留病(MRD)、任何可能导致复发的切除手术后残留的肿瘤成分，以及估计复发的机会[37]。切除的肿瘤样本可以进行分析，作为对每个人自身的纵向监测的参考[38]。对于具有乳腺癌易感基因突变的高风险人群，使用液体活检同样可以使他们及早获益[39-40]。然而，对于这种人群，通过液体活检早期发现乳腺癌的挑战在于，他们确切的肿瘤突变特征尚不清楚，以便在他们的cfDNA中进行搜索。正因为如此，我们应该对大量已知的乳腺癌驱动基因进行筛查，以提高敏感性。同时，对于cfDNA分析中可能发现的来源于非肿瘤细胞的体细胞致癌突变，我们应该非常谨慎。未来的研究应该集中在开发随机体细胞突变率最低的乳腺癌致癌基因或突变小组，这些小组可以通过液体活检在高危群体中，甚至在普通人群中早期发现乳腺癌。以前的研究已经证明，利用液体活检来测量cfDNA水平，使我们能够在临床和放射检查之前5个月就发现和诊断乳腺癌[41]。

4 展望

分子技术的最新进展增强了液体活检在乳腺癌治疗中的潜在用途。近5年来，随着NGS、ddPCR和分子条形码等技术的发展，液体活检在临床上的应用潜力得到了广泛的研究。多项研究表明，使用液体活检作为乳腺癌患者早期发现和纵向监测的一种方法具有优势。同时cfDNA检测是一种可重复的无创方式进行的，这对于一些癌症晚期患者可以多次检测，并动态检测肿瘤细胞的变化情况。乳腺癌的异质性不仅导致取材的不全面性，而且产生药物选择上的一些问题，增加了对更个性化治疗的需求，这些都可以通过液体来实现。并且还可以直接获取肿瘤细胞的基因组的相关信息，可以用于指导后续的相关靶向治治疗。

尽管研究已经证明了液体活检在乳腺癌治疗中的有用性和利用率，但在它可以在临床上常规使用之前，仍有几个挑战需要解决。例如，cfDNA的定量还不能用于乳腺癌检测，因为它的敏感度和特异度都很低。因此，cfDNA中检测到的基因改变需要与其水平变化相结合，并结合其他生物标志物和成像技术来提高其敏感性和特异性。此外，还需要优化cfDNA分离技术，以提高提取得率，并提高现有DNA分析技术在极低等位基因频率下检测ctDNA的灵敏度。最重要的是，在将其整合到临床之前，还需要对cfDNA进行进一步的研究，特别是它的起源组织和生物学意义。总之，液体活检有可能为乳腺癌的筛查和治疗创造新的视野。然而，到今天为止，液体活检最好作为二线诊断工具，建立在主要从经典组织活检获得的结果的基础上。需要进一步的研究来克服目前这种方法的缺点，并为其在临床环境中的应用建立标准化的方案。