胸腺基质淋巴细胞生成素在支气管哮喘中的作用机制研究

刘名伟，熊丽娇，曾治平,3

(1.赣南医学院第一临床医学院，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000；3.国家老年疾病临床医学研究中心江西分中心，江西 赣州 341000)

0 引言

哮喘是一种异质性疾病，可由运动、变应原或刺激物暴露、天气变化或病原体感染等因素诱发[1]。全球至少有3亿哮喘患者，在不同国家比例不等，且近年来哮喘患病率不断升高，造成沉重的社会经济负担[2]，部分哮喘患者症状控制不佳，生活质量差，甚至死亡，进一步研究哮喘发病机制能更好地指导哮喘治疗。哮喘发病机制尚不明确，目前认为哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，表现为气道多种炎症细胞浸润如嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞、T淋巴细胞，多种炎性介质及和细胞因子分泌。研究表明：胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)主要在过敏性疾病中表达升高，与哮喘相关，作为一种上游细胞因子[3]，在哮喘急性发作及气道炎症浸润、气道高反应性(AHR)和气道重构中起重要作用。

TSLP属于IL-2家族，是一个含有140个氨基酸、由三个二硫键稳定的四螺旋束蛋白[4]。TSLP的人类基因定位于染色体 5q22.1，该染色体紧邻编码细胞因子白介素4(IL-4)、IL-5、IL-9 和 IL-13 的特应性细胞因子基因簇 5q31[5]。TSLP可由多种因素诱导，如机械损伤、过敏原、香烟烟雾、Toll样受体信号及细菌、真菌、病毒等病原体[5,6]。TSLP主要由肺和皮肤来源的上皮细胞表达，也可由树突状细胞(DC)、气道平滑肌(ASM) 细胞、肺纤维细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞表达[7]，能作用于广泛的效应细胞，如DCs、EOS、CD4+T细胞、B细胞、2型固有淋巴细胞(ILC2)、自然杀伤细胞(NK)[8,9]。TSLP带正电荷，以高亲和力和快速动力学与带负电荷的TSLP受体(TSLPR)结合形成TSLP-TSLPR初始二元复合物，该分子将产生负静电势，从而募集带正静电势的IL-7受体ɑ(IL-7Rɑ)，当TSLP与TSLPR、IL-7Rɑ结合后形成TSLP-TSLPR- IL-7Rɑ高亲和力三元复合物，启动下游一系列炎症途径[4]。以下就TSLP的诱导、与细胞表面受体结合、下游效应做进一步阐述。

1 TSLP产生的诱导

气道上皮持续参与免疫监视，它通过表达广泛的感觉受体包括 RNA 螺旋酶受体、核苷酸结合和寡聚化结构域样受体和Toll样受体(TLRs)以相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式 (DAMPs)识别病原体[10]。其中Toll样受体，作为黏膜防御的第一线，识别、处理和清除入侵的微生物[11]。细胞间上皮连接紧密连接、粘附连接和桥粒组成，维持气道上皮屏障完整性的结构黏附力。在哮喘患者中，外界因素(如变应原、污染物和感染原)使气道中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平升高，TNF-α破坏紧密连接或由于病原体本身的蛋白酶水解特性最终导致气道屏障功能受损，气道上皮细胞感受到威胁，释放一系列上皮源性警报素TSLP并激活固有免疫细胞和适应性免疫细胞，帮助恢复内环境稳定[12]。

研究表明[13]，卵清蛋白(OVA)、屋尘螨(HDM)和真菌急剧上调了肺中Toll 样受体2(TLR2)表达，诱导气道TSLP信使RNA(mRNA)、C-C 趋化因子配体-2 (CCL2) 表达显著增加，用TLR2小干扰RNA抑制其表达后，TSLP表达显著减少，表明TLR2是诱导气道上皮细胞表达TSLP的关键因素。变应原诱导TLR2表达上调后通过核因子κB(NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路促进TSLP和CCL2的产生。目前认为，病毒性呼吸道感染是哮喘急性发作的最常见原因，与哮喘加重相关的呼吸道病毒包括鼻病毒、呼吸道合胞病毒 (RSV)、肠道病毒、流感病毒A/B、副流感病毒、冠状病毒和腺病毒，鼻病毒在急性发作期最常检出[14]，其感染人上皮细胞可诱导TSLP、双调蛋白、激活素A和血管内皮生长因子(VEGF)水平显著上调[15,16]。此外，一项研究显示，TSLP可被甲苯二异氰酸酯(TDI)诱导表达，进一步使调节因子RORt、IL-17ɑ的mRNA 表达也增加，介导Th17/Treg 细胞免疫失衡，在TDI诱导的哮喘中起作用[17]。

2 TSLP通过不同细胞和细胞因子介导气道炎症

2.1 TSLP与DC

吸入性变应原刺激气道上皮细胞产生TSLP，激活DC释放趋化因子CC-趋化因子配体17(CCL17)和CCL22，募集辅助性T细胞2(Th2)和ILC2s，Th2细胞和ILC2s中转录因子3(GATA3)的活化导致细胞因子IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13的分泌[18]。DC具有强大的激活naïveT细胞的能力，从而在启动适应性免疫中发挥关键作用，在放大Th2细胞介导的气道炎症中也发挥重要作用[19]。

2.2 TSLP与Th2细胞

Th2细胞是一种效应T细胞，可从naïve CD4+T细胞分化形成，能够抵御细胞外寄生虫，也可在上皮细胞和天然免疫细胞分泌的TSLP刺激下产生IL-4、IL-5和IL-13[20]。TSLP通过多种途径强烈参与Th2细胞介导的变态反应性疾病，包括过敏性哮喘、特应性皮炎、食物过敏和嗜酸性粒细胞性食管炎[21]。

2.2.1 TSLP通过两面神激酶2(JAK2)和信号传导及转录激活蛋白5(STAT5)诱导Th2细胞因子表达

使用IL-4CD4+T细胞和JAK2选择性抑制剂进行实验，结果表明，JAK2抑制剂II阻断了TSLP诱导的STAT5磷酸化，TSLP 诱导的IL-5和IL-13基因被JAK2 抑制剂取消，但未阻断IL-4 诱导的STAT6磷酸化和IL-7依赖于激酶JAK1和JAK3诱导的STAT5的磷酸化，IL-4信号转导对Gata3表达的诱导也未受影响。STAT5 缺失时，TSLP信号无法诱导Th2细胞因子基因的表达。证实TSLP通过JAK2-STAT5诱导Th2细胞因子表达。

2.2.2 TSLP通过抑制Bcl6促进Th2细胞因子基因表达

将TSLP来源的Th2细胞称为Th2TSLP细胞，将外源性添加IL-4产生的Th2细胞称为Th2IL-4细胞，通过PCR测定证实：两种细胞被抑制的基因中，Bcl6在Th2TSLP细胞中受到的差异最大，进一步用编码Bcl6的逆转录病毒载体转导活化的CD4+T 细胞。活化CD4+T细胞中Bcl6的强制表达消除了TSLP诱导的Th2细胞因子基因的表达，TSLP信号对Bcl6的抑制不受JAK2-STAT5通路抑制的影响。Bcl6直接抑制CD4+T细胞中IL-4、IL-9 和IL-13的表达，因此TSLP通过抑制Bcl6导致Th2细胞因子的产生增加[22-24]。

TSLP通过这两种不同的分子途径促进Th2细胞分化，两条途径发挥协同作用，在 Bcl6持续表达的情况下，STAT5活化不能诱导Th2细胞因子基因表达。相反，在STAT5A和 STAT5B不存在的情况下，TSLP介导的Bcl6表达抑制不足以使IL-5和IL-13的表达增加。

2.2.3 TSLP直接促进Th2 细胞分化

在不涉及干扰素调节因子4(IRF4)活化改变或提高Th2存活或增殖情况下，与IL-4诱导Th2细胞分化的作用相比，TSLP使Th2细胞产生IL-4、IL-5和IL-13的作用更显著，并增加每个细胞产生IL-5和IL-13的量，导致IL-4、IL-5和IL-13的分泌增加，可能通过一条或多条额外的信号通路与JAK-STAT5通路联合使用，有效驱动Th2 细胞分化。虽然IL-4是由正在分化为Th2细胞的活化CD4+T细胞产生，但T细胞活化初期体内IL-4的来源仍未解决，有研究表明，TSLP促进Th2细胞分化产生的IL-4作用于Th2自身可能对早期Th2型免疫应答起作用，TSLP联合T细胞受体(TCR)活化诱导IL-4和IL-9的分泌，IL-4增加也使CD4+T细胞表面TSLPR的表达，提示两种细胞因子之间存在正反馈作用，TSLP和IL-4协同促进Th2细胞生成，产生大量的IL-4、IL-5和IL-13[25-28]。在IL-4存在的情况下，TSLP增强Th2细胞因子基因位点H3K27ac染色质修饰，使Th2型细胞因子表达增加。

2.3 TSLP与ILC2s

ILC2s在包括过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎伴鼻息肉和哮喘在内的人类气道2型炎症疾病中明显升高，ILC2s 表达GATA3并产生Th2细胞因子，鉴于ILC2s产生大量2型炎症因子，ILC2s越来越被认为是2型炎症的关键控制因子[29、30、31]，且至少需要3个主要信号通路才能充分激活ILC2s并大量产生2型细胞因子。IL-1家族细胞因子(IL-1b、IL-18、IL-33)、IL-25 和TNF超家族(TNF、TL1A、GITR-L、RANK-L) 激活启动IL-5和IL-13生成的NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)通路。神经肽NMU通过活化T细胞核因子(NFAT)通路促进IL-4的产生。TSLP诱导ILC2s存活并增强细胞因子产生的STAT5通路，STAT5的激活被认为是促进ILC2功能的关键通路，TSLP激活STAT5使NF-κB和AP-1转录增加，引起IL-4、IL-5和IL-13表达增加，TSLP是ILC2s介导的2型炎症的共刺激因子和增强因子[32]。

2.4 TSLP与EOS

EOS是一种先天免疫系统的效应细胞，在哮喘发病机制中起重要作用，内含细胞毒性颗粒，脱颗粒时释放大量毒性蛋白，如EOS衍生的神经毒素(EDN)、阳离子蛋白(ECP)、过氧化物酶(EPO)、主要碱性蛋白(MBP)、细胞因子介导活化的IL-5和脂质介质，如半胱氨酰白三烯(cysLTs)[33]。EOS的募集很可能通过整合素4/血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)粘附于内皮细胞，IL-4和IL-13可上调VCAM-1表达，气道EOS浸润的发展和维持是cysLTs和Th2型炎症因子共同作用的结果[34]。EOS可能通过产生转化生长因子β(TGF-β)和cysLTs 在气道重塑中发挥作用，并通过MBP诱导AHR[35]。TSLP通过促进Th2产生IL-4和 IL-13，使EOS数量明显增加，并延缓EOS凋亡，还可上调粘附分子CD18、VCAM-1的表达，下调L-选择素的表达，显著增强EOS浸润，促进EOS的活化和趋化，在过敏性哮喘中起重要作用[36,37]。

3 TSLP与气道重构、AHR

哮喘的特征包括AHR，可能原因为气道上皮细胞对外界因素刺激时诱导产生的支气管收缩介质的敏感性增加，以及气道中传入神经的敏感性增加[38]，此外还可能涉及EOS、肥大细胞和淋巴细胞等对气道的浸润，以及正常气道结构的持续性改变，包括ASM肥大或增生、网状基底膜增厚导致的上皮下纤维化、上皮黏液化生和血管生成[39,40]。TSLP通过直接或由DC细胞介导间接作用于Th2细胞和ILC2s使GATA3活化增加导致细胞因子IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13的分泌增加。IL-4 和IL-13激活共同受体IL-4受体α(IL-4Rα)，导致杯状细胞化生和气道纤维化。IL-5作用于IL-5受体(IL-5R)引起EOS增多，也可在气道重塑中起作用。IL-9有助于T细胞增殖和分化、肥大细胞增生和杯状细胞增生，对上皮细胞的完整性很重要[41,42]。一项建立在OVA诱导大鼠模型的研究表明，抗TSLP单克隆抗体明显下调了小鼠OX40L(一种瞬时表达于活化T细胞上的共刺激受体的配体)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白I、IL-4、IL-5、IL-13水平，抗TSLP单克隆抗体组与正常对照组相比，气道重构情况相同[43]。

4 TSLP介导ILC2s类固醇抵抗

一项研究表明：地塞米松抑制血液中Th2细胞上化学趋化因子受体和2型细胞因子的表达，IL-7和TSLP 消除了这种抑制作用。哮喘患者的支气管肺泡灌洗液ILC2s 对地塞米松耐药，地塞米松抑制DNA 结合抑制剂3(ID3)、c-Fos和磷酸化信号转导子和转录激活子3(pSTAT3)表达，但不能抑制TSLP介导的促分裂原活化蛋白激酶激酶MEK-pSTAT5表达，上调ILC2s表面IL-7和TSLP共同受体IL-7Rα表达，促进了TSLP对ILC2s中pSTAT5和(MEK)的增强和持续诱导，pSTAT5 和MEK持续诱导将激素敏感性ILC2s转化为激素耐药细胞，MEK、STAT5抑制剂能逆转类固醇抗性。TSLP通过IL-7Ra的上调在哮喘患者气道ILC2s类固醇抵抗中起重要作用[44]。

5 TSLP单克隆抗体效应

TSLP单克隆抗体-Tezepelumab 是首个对哮喘炎症的两个重要标志物即血液EOS计数和呼出气一氧化氮 (FeNO) 具有实质积极作用的生物制剂。一项研究对象为长效β2受体激动剂(LABAs)联合中高剂量吸入性糖皮质激素(ICS)治疗后病情仍未控制患者的随机、安慰剂对照、剂量范围探索试验显示：Tezepelumab降低了血液EOS计数、FeNO和血清总免疫球蛋白E(IgE)水平，还可抑制变应原激发后痰、血液EOS计数和FeNO水平升高，抑制早期和晚期哮喘反应，对IL-4、IL-5、IL-13通路具有重要作用，抑制TSLP可能比单个Th2细胞因子的靶向作用具有更广泛生理效应。tezepelumab组和安慰剂组相比，不良反应发生率相当，部分哮喘患者急性加重的年发生率降低，与EOS计数或其他Th2生物标志物基线水平无关[45]。

6 小结

TSLP在多种因素作用下由多种细胞产生，通过复杂机制，作用于下游效应细胞，产生多种的细胞因子或炎症介质，引起气道炎症浸润、气道高反应性、气道重构和气道黏液分泌，最终引起气道不可逆性气流受限，TSLP作为上游因子在哮喘中起重要作用。抗TSLP单克隆抗体Tezepelumab能够降低哮喘生物标志物水平，使部分患者哮喘急性加重次数减少，是一种新型的哮喘治疗药物，给难以控制哮喘患者治疗提供了新的思路。