转录组—代谢组联合分析揭示低温下采后雷竹笋木质化分子调控机制

侯 丹 林新春

(浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室 杭州 311300)

竹笋作为一种天然蔬菜，富含各种营养物质和活性化合物，如膳食纤维、抗氧化物、氨基酸和维生素等，深受人们喜爱。雷竹是中国特有的栽培竹种，其出笋早、产量高，产量可达1 500～2 000 kg/667 m2，价格可达20 元/kg 左右，收益可达3 万～7 万元/667 m2，是经济效益最高的竹种。然而，以雷竹为代表的笋用竹产地主要集中在山区，且采收期多集中于高温高湿之际，使得竹笋采后由于消耗体内大量水分和营养物质而迅速老化(木质化) 褐变，在常温下2～3 d 内即失去商品价值和食用价值，降低经济效益。因此，如何有效保鲜是雷竹笋采后贮藏和运输过程面临的重要问题。

竹笋老化过程即木质化过程，该过程与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、过氧化物酶(POD) 等酶活性密切相关。低温是最主要的竹笋采后保鲜措施，其主要通过抑制上述关键酶的活性来降低采后竹笋的木质化、纤维化以延缓其衰老。此外，植物激素，例如赤霉素(GA3)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯抑制剂(1-MCP) 等也可延缓PAL、CAD、POD 等酶活性来延迟竹笋采后保鲜时间。然而，目前竹笋低温贮藏研究大部分停留在表型和生理指标检测方面，关于其分子调控机制知之甚少。特别是关于木质化和低温通路、植物激素通路的内在关联尚不清楚。因此我们针对上述问题展开研究，力图揭示究竟哪些因素影响了雷竹笋采后老化? 为什么低温可以有效延长雷竹笋的采后保鲜时间? 植物激素是否参与了该过程调节? 哪些基因发挥了重要作用?

综上所述，以雷竹笋为材料，利用不同温度处理明确低温对竹笋保鲜的重要作用，通过“转录组—代谢组”联合分析，揭示低温下采后雷竹笋中主要的次生代谢物质和关键基因，提出了“低温—茉莉酸—木质化”的潜在调控通路，该结论不仅在一定程度上丰富了竹笋保鲜现有研究，还为茉莉酸在竹笋采后贮藏、冷链运输中的应用提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

雷竹笋主要采自于浙江省杭州市临安区浙江农林大学校园内(30°15′ N，119°43′ E)，从基部将笋切开，收集后快速将其带回实验室，分别测量样品长度和质量，选取高度 (20.12±2.87)cm、质量(140.48±16.99) g 的鲜笋进行常温和低温处理，不同处理设置4 个生物学重复，每个重复30 颗笋，分别在处理0、2、4、6、14 和20 d 后采样，样品保存于－80 ℃超低温冰箱中。

1.2 表型观察和生理指标检测

观察不同温度处理下雷竹笋表皮、切口等变化，测量质量，计算失水率；根据说明书，利用紫外分光光度计分别在290 和470 nm 下测定PAL和POD 酶活；同时利用紫外分光光度计在280 nm下测定总木质素含量。

1.3 转录组和代谢组测序

提取样品RNA，质检合格后进行cDNA 文库构建，对测序获得的原始数据进行过滤后进行功能注释和通路分析，筛选差异表达基因；利用LC-MS/MS 技术，对采后竹笋中的次生代谢物质进行分离鉴定和定量分析，筛选差异代谢物。最后，使用Cytoscape 进行代谢物—基因联合分析和共表达网络构建。

2 结果与讨论

2.1 低温可显著延缓采后雷竹笋衰老

在常温下，采后雷竹笋在4 d 后则严重腐烂变质。但在低温下，采后雷竹笋仍然十分新鲜(原文图1a)，分别对失水率进行检测发现，常温下样品在采后第6 d 失水率高达12%，但低温下采后第20 d，样品的失水率仅为8.5% (原文图1b)。此外，常温下雷竹样品的POD 和PAL 酶上升显著，在第4 d 达到最大值，但在低温下，雷竹样品中POD 和PAL 酶活性上升缓慢，且与CK相比，在前4 d 无显著性差异(原文图1c、d)。综上所述，低温贮藏是抑制采后雷竹笋衰老的有效方式。

2.2 植物激素和木质素合成通路代谢物在采后雷竹笋中显著积累

通过代谢组测序，共鉴定了145 个差异代谢物。在本研究中，主要关注了植物激素通路和木质化通路，结果表明，在植物激素通路中，茉莉酸在低温贮藏的笋中显著积累，但脱落酸(ABA)、GA 和乙烯前体物质(ACC) 变化不显著；在木质化通路中，木质素合成前体物质香豆素、4-香豆素酸、反式阿魏酸和L-苯丙氨酸在低温贮藏20 d 后显著积累(原文图2)。本研究进一步通过HPLC 对上述物质的含量进行检测，发现其变化趋势与代谢组测定结果一致，说明代谢组数据可信。因此认为，与常温相比，低温可以显著诱导茉莉酸在采后雷竹笋中的合成，同时可以明显延迟木质素的生物合成。

2.3 植物激素和木质素合成通路相关基因在采后雷竹笋中差异表达显著

通过转录组测序，本研究在CK vs LT-1、CK vs LT-2、CK vs LT-3中分别鉴定了10 349、12 192、和13 987 条差异代谢物质，我们重点关注了茉莉酸合成通路和木质素合成通路关键调控基因的表达模式，结果表明，大部分茉莉酸合成通路基因在低温贮藏中的雷竹笋中差异表达显著，例如PvJAZ-2、PvJAZ-3、PvJAZ-4、PvJAZ-8、PvJAZ-11和PvJAZ-12显著上调。通过荧光定量PCR 对结果进行验证，发现这些基因在低温下表达趋势与转录组一致，并且大部分基因的表达量显著高于常温保存样品，因此低温可以显著诱导采后雷竹笋中茉莉酸合成基因的表达(原文图3)。此外，本研究通过共表达分析发现，4 个茉莉酸合成基因PvLOX5、PvOPR2、PvPEX5和PvJAZ-4与茉莉酸呈显著正相关，可能在低温贮藏雷竹笋中茉莉酸的合成过程发挥重要作用(原文图S8a)。

本研究还对木质素合成通路基因表达模式进行了分析，结果表明，大部分木质素合成基因，例如PvPAL-2/4/6、PvC4H-3/4、PvHCT-2、PvCCR-2/3/4、PvCAD-2/3/4、PvCoMT-2/3在低温贮藏的雷竹笋中显著下调，说明木质素合成可能被抑制。对这些基因表达模式进行qRT-PCR 验证，结果发现他们的表达趋势与转录组一致，且大部分低于常温下雷竹笋中的表达量，说明低温可以显著抑制木质素合成基因表达(原文图4)。通过共表达网络分析发现，共24 条木质素合成基因与木质素合成前体物质显著相关，其中PvHCT-9，PvC4H-2/3，PvC3H-1，Pv4CL-5和VND7与香豆素、4-香豆素酸、反式阿魏酸和L-苯丙氨酸这4个前体物质均呈极显著正相关，说明这些基因在低温贮藏雷竹笋中木质素合成过程中发挥了重要作用(原文图S8b)。

2.4 “低温—植物激素—木质素合成”通路基因显著关联

本研究对低温通路基因的表达模式进行分析，发现PvCRPK-1/3/4/5、PvWCOR410c、PvICE1-1/2和PvDREB2B/2C在采后雷竹笋中显著上调，进一步与关键的木质素合成基因、茉莉酸合成基因建立共表达网络发现，PvCRPK-4/-5、PvICE2-1/2和PvDREB2B为该网络中的中心基因，它们分别和10 条以上其他基因相关联，其中负相关基因主要包括木质素合成通路基因，例如PvNST1/2-1、PvC3H-2/3、PvC4H-2/4、PvCAD-1/2/3/4、PvCCR-2/4、PvHCT-2/5/8、PvPAL-2/4/6；正相关基因主要为茉莉酸合成基因，包括PvOPR2、PvJAZ-4和PvPEX5。此外，PvOPR2、PvJAZ-4和PvPEX5同样与一系列木质素合成基因，例如PheC3H-2/3、PheCAD-1/2/3/4、PheHCT-2/5/8和PhePAL-6显著负相关(原文图5)。上述结果说明，低温通路、茉莉酸通路和木质素合成通路基因可能通过形成调控网络共同参与采后雷竹笋衰老调控。

3 结论

本研究通过“转录组—代谢组”联合分析，初步揭示了低温调控采后雷竹笋木质化的2 条潜在通路:“低温—木质素通路”和“低温—茉莉酸—木质素通路”(原文图6)，并发现与常温相比:1) 低温可以显著延缓采后雷竹笋保鲜时间至少20 d，在此过程中茉莉酸显著积累，可能是低温下延迟竹笋保鲜的重要植物激素；2)

PvOPR2、PvJAZ-4、PvPEX5、PvC3H-2/3、PvC4H-2/4等基因在低温处理采后雷竹笋中差异表达显著，可能是调控低温下竹笋保鲜的重要因子。上述结论为采后竹笋贮藏和保鲜分子机制提供了新的理论依据，可为今后茉莉酸在采后雷竹笋保鲜应用以及利用分子生物学手段改良竹笋贮藏特性等提供一定的科学基础。

原文出处

DanHou，Haiwen Lu，Zhongyu Zhao，Jialong Pei，Huqing Yang，Aimin Wu，Xuejun Yu*，Xinchun Lin*.Integrative transcriptomic and metabolomic data provide insights into gene networks associated with lignification in postharvest lei bamboo shoots under low temperature[J].Food Chemistry，2021.https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.130822.