银杏叶黄酮主要组分及其配比的抗氧化性作用

曹永富 李广云 赵丹 郁万文

摘要：  对槲皮素、山奈酚、异鼠李素3种银杏黄酮主要组分及其复配溶液抗氧化能力的研究结果表明：（1）槲皮素、山奈酚、异鼠李素可有效清除DPPH自由基，具有相当的总还原力，且随着浓度的增加而增加，具有剂量效应;清除DPPH自由基能力、总还原力均为槲皮素>山奈酚>异鼠李素。（2）3个主要组分的配比显著影响了复配液的总还原力，T7（3：1：3）和T4（2：1：2）是2个较好的复配处理。（3）槲皮素、异鼠李素配伍具有提高清除DPPH自由基清除能力的作用，槲皮素与山奈酚、山奈酚与异鼠李素配伍均降低清除DPPH自由基清除能力;槲皮素、异鼠李素配伍具有削弱总还原力的作用，而槲皮素与山奈酚、山奈酚与异鼠李素配施提高总还原力。

关键词：  银杏黄酮;  主要组分;  复配;  抗氧化性

中图分类号：   S 792. 95               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2021）04 - 0010 - 05

银杏叶中的黄酮类化合物具有高效的抗氧化性，早已被人们所重视并加以利用。黄酮类化合物的抗氧化能力与其结构密切相关，因其本身结构的不同，抗氧化能力的大小也各不相同[ 1 - 3 ]。有关文献报道，银杏叶中的黄酮甙类化合物清除超氧阴离子（O·-）能力由大到小的顺序为槲皮素、杨梅树皮素、芦丁、槲皮甙[ 4 ， 5 ];各银杏黄酮苷元组分（槲皮素、山柰酚、异鼠李素）均具有清除自由基能力，黄酮与内酯合用可以增强清除DPPH自由基的能力[ 6 ];在紫外线氧化体系中，银杏叶中的黄酮甙类化合物同样表现出较强的抗氧化能力，且抗氧化能力存在差异，其中槲皮素甙类表现出最好的抗氧化效果[ 4 ]。从众多的银杏叶中黄酮化合物中筛选并分离出抗氧化效果最好的组分，对于银杏叶开发制药有着重要意义。已知在银杏叶所含的黄酮甙中，主要是山奈酚甙、异鼠李素甙、槲皮素甙，三者之间是否存在一个抗氧化能力最佳的复配比例？ 基于上述设想，将山奈酚、异鼠李素、槲皮素纯品进行复配，研究不同组分及其复配物的抗氧化能力差异，筛选出最佳的组分及其复配比例及剂量，为高抗氧化银杏种质的筛选提供科学依据。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

银杏叶中3种黄酮组分——槲皮素、山奈酚、异鼠李素购置于上海源叶生物科技有限公司，均为分析标准品，HPLC≥98%。

1. 2 主要组分溶液的制备方法

称取槲皮素甙、异鼠李素甙各5 mg，置于200 mL无水乙醇中，充分溶解后，得到25 mg·L-1的槲皮素、异鼠李素母液;称取山奈酚甙7 mg，置于200 mL无水乙醇中，充分溶解后，得到35 mg·L-1的山奈酚母液。再将槲皮素、异鼠李素母液用无水乙醇稀释成10.0、7.5、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05 mg·L-1的系列溶液;将山奈酚母液用无水乙醇溶液稀释成7、4.2、1.4、0.7、0.42、0.28、0.14、0.07、0.028 mg·L-1的系列溶液，无水乙醇作为对照CK，置于4 ℃冰箱中待用。

1. 3 复配溶液的制备方法

按照银杏主要组分复配比例及其在复配液中的浓度（表1）中的比例，吸取槲皮素、异鼠李素和山奈酚母液进行复配，分别记作T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9，置于4 ℃冰箱中待用。

1. 4 测定指标与方法

1. 4. 1 总还原力

参考现有的方法[ 7 ]，略有改动。吸取0.3 mL提取液于10 mL试管中，然后加入3 mL FRAP工作液。工作液成分为300 mmol·L-1的pH3.6的醋酸盐缓冲液（3.1 g醋酸钠+16 mL冰醋酸，并用蒸馏水定容至1 000 mL）25 mL，10 mmol·L-1的TPTZ溶液（用40 mmol·L-1盐酸配制）2.5 mL，20 mmol·L-1的FeCl3·6H2O 2.5 mL，混合而成，现配现用。充分混匀后，37 ℃水浴避光10 min，在593 nm处测定吸光值。以甲醇替代样品作为空白，每个样品重复3次。以FeSO4为标准物，配成不同浓度的FeSO4溶液，采用同样的方法制作标准曲线，计算总还原力。以不同FeSO4浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制曲线，曲线方程：y=1.094 2x+0.072 7，R2=9 998。样品测定的吸光值得到的吸光值代入曲线方程，解得的x值即为样品总还原力，即以达到同样的抗氧化能力时，所需的FeSO4·7H2O物质的量。

1. 4. 2 黄酮对DPPH自由基的清除作用

参考现有方法[ 8 ]，吸取0.2 mL银杏叶提取液与4 mL DPPH-乙醇溶液（40 mg·L-1）于10 mL比色管，充分混匀，室温避光静置30 min后，于517 nm下测定吸光值A样品。为去除提取液底色的影响，以等量无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液测定吸光值A对照，以等量无水乙醇代替提取液测定吸光值A空白。每個样品重复3次。计算清除率，公式为：

DPPH·清除率（%）=1-[（A样品-A对照）÷A空白]×100%。

1. 5 数据处理方法

采用Excel 2016和DPS7.04统计分析软件对数据进行处理和方差分析，运用Turky法进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 不同浓度银杏叶黄酮主要组分溶液对总还原力的影响

由图1～图3可知，银杏叶黄酮主要组分槲皮素、山奈酚和异鼠李素的总还原力存在明显的剂量效应，即随着浓度的升高呈线性增长趋势。根据相应的线性方程y=ax+b的a值大小可知，总还原力由高到低的顺序为槲皮素（0.021 3）、山奈酚（0.010 5）、异鼠李素（0.006）。

2. 2 不同浓度银杏叶黄酮主要组分溶液对DPPH自由基清除率的影响

由图4～图6可知，银杏叶黄酮主要组分槲皮素、山奈酚和异鼠李素清除DPPH自由基的能力存在显著的剂量效应，即随着浓度的升高呈增长趋势，其中槲皮素在高浓度下表现出饱和效应，即当槲皮素浓度超过7.5 mg·L-1后，槲皮素清除效果增长变缓。根据相应的线性方程y=ax+b的a值大小可知，清除DPPH自由基能力由高到低的顺序为槲皮素（0.106 8）、山奈酚（0.074 6）、异鼠李素（0.024 8）。

2. 3 不同比例的复配溶液对总还原力的影响

方差分析和多重比较结果表明，不同配比的总还原力间存在极显著性差异（p<0.01），表明3个主要组分的配比显著影响了复配液的总还原力（图7）。所有配比的总还原力由高到低的顺序为T7、T4、T8、T9、T5、T1、T6、T2、T3。其中，T7的总还原力仅与T4和T8处理不显著，显著高于其他6个处理，而T2、T3和T6三个处理的总还原力最差。

将9个处理的总还原力及主要组分配比浓度进行非线性回归分析，求得槲皮素X1、山奈酚X2、异鼠李素X3浓度与总还原力，数学模型为：Y还原力=  5 361.549-299.152X1+3.388X12 -628.802X2+13.588X22 -8.577X32+ 21.448X1X2 -5.193X1X3+12.899X2X3。对方程及其回归系数的显著性检验表明方程F检验极显著（p<0.01），拟合程度高;回归系数检验表明，常数项及二次项、一次性X1、X2的偏回归系数均达显著水平（p<0.05）。根据方程的一次项回归系数可知，在复配液中X1、X2对总还原力的影响均为负效应，且X2>X1，而X3的作用可忽略;二次项中X1、X2、X3的偏回归系数分别为3.388、13.588和-8.577，表明X1、X2起正作用，且X2>X1，而X3起负作用。交互项中X1X2、X2X3的偏回归系数大于0，为正向交互作用;X1X3的偏回归系数小于0，为负向交互作用，表明X1X3配伍具有削弱总还原力的作用，而X1X2、X2X3配施提高了总还原力。

2. 4 不同比例的复配溶液对清除DPPH自由基能力的影响

方差分析和多重比较结果表明，不同配比处理清除DPPH自由基能力间存在极显著性差异（p<0.01），表明3个主要组分的配比显著影响了复配液的清除DPPH自由基能力（图8）。所有配比的清除DPPH自由基能力由高到低的顺序为T7、T4、T1、T5、T2、T6、T3、T9、T8。其中，T7的DPPH自由基清除率极显著高于其他8个处理，其次为T4、T1、T5，最差的是T8。

将9个处理的清除DPPH自由基能力及主要组分配比浓度进行非线性回归分析，求得槲皮素X1、山奈酚X2、异鼠李素X3浓度与DPPH自由基清除率，数学模型为：YDPPH= -3 106.669+108.414X1+  0.635X12+410.813X2-9.200X22+4.971X32-12.429X1X2+

5.609X1X3-9.332X2X3。回归系数检验表明，常数项及二次项、一次性X1、X2的偏回归系数均达显著水平（P<0.05）。根据方程的一次项回归系数可知，X1、X2对清除DPPH自由基能力的影响均为正效应，且X2>X1，而X3不起作用。二次项中X1、X2、X3的偏回归系数分别为0.635、-9.200、4.971，表明X1、X3起正作用，且X3>X1，而X2起负作用。交互项中X1X2、X2X3的偏回归系数小于0，为负向交互作用;X1X3的偏回归系数大于0，为正向交互作用，表明X1X3配伍具有提高清除DPPH自由基能力的作用，而X1X2、X2X3配施降低清除DPPH自由基能力。

3 结论与讨论

3. 1 槲皮素、山奈酚、异鼠李素可有效地清除DPPH自由基，具有相当的总还原力，且随着浓度的增加而增加，具有剂量效应;清除DPPH自由基能力、总还原力均为槲皮素>山奈酚>异鼠李素，这与张英等[ 3 ]、宋唯唯等[ 9 ]、刘娜[ 6 ]的研究结果一致。研究中，除了找到槲皮素清除DPPH自由基能力的剂量外，山奈酚、异鼠李素清除DPPH自由基能力及三者的总还原力均未能找出饱和剂量，后期将进一步研究。

3. 2 银杏叶黄酮主要组分配伍的抗氧化作用研究表明，总还原力和DPPH自由基清除率在不同复配处理间存在极显著差异，说明3个主要组分的配比显著影响了复配液的总还原力。其中，T7和T4是两个较好的复配处理，值得注意的是T8和T9的总还原力较高，但其DPPH自由基清除率却较低，相关原因有待进一步深入研究。

3. 3 T1处理的槲皮素、山奈酚、异鼠李素比值为1∶1∶1，银杏黄酮的抗氧化性适中，而T2处理保持槲皮素含量不变，同时增加等量异鼠李素和山奈酚含量，黄酮溶液的抗氧化效果较T1处理却有所下降;T3处理中，进一步增加等量异鼠李素和山奈酚，保持槲皮素含量不变，使得T3处理液中，槲皮素得浓度最低，而黄酮的抗氧化性较T2也有所下降。在T4、T7处理中，槲皮素含量提高，增加了槲皮素浓度，这两组黄酮处理液的抗氧化性最好。以上数据表明，在3种银杏黄酮类化合物中，槲皮素浓度越高，黄酮的抗氧化性越好。比较T5、T6处理，槲皮素浓度保持不变，T5的山奈酚浓度较高，异鼠李素浓度较低;T6的山奈酚浓度较低，异鼠李素浓度较高，最终T5处理的抗氧化性好于T6。比较T7、T8处理液，T7的山奈酚浓度高，异鼠李素浓度低;T8的山奈酚浓度较低，异鼠李素浓度高，T7处理抗氧化性明显好于T8。比较T8、T9处理中，T9的异鼠李素浓度和山奈酚浓度均高于T8，但其浓度均不高于槲皮素浓度，且山奈酚和异鼠李素浓度相差不多，T8、T9处理液的抗氧化性差别并不明显。因此，可认为T8、T9发挥主要抗氧化性作用的是槲皮素。比较T5、T6处理液以及T7、T8处理液，槲皮素含量保持不变，山奈酚浓度高的抗氧化性要優于异鼠李素浓度高的，因此认为山奈酚浓度对抗氧化性的影响略高于异鼠李素浓度对抗氧化性的影响，而槲皮素的浓度对抗氧化性的影响明显高于山奈酚以及异鼠李素，这与单一组分抗氧化性能力槲皮素>山奈酚>异鼠李素的结论一致[1 - 4 ， 6 ， 9 ]。而在9个复配处理中，T7的两个指标抗氧化均较高，因此认为T7处理的槲皮素、异鼠李素、山奈酚三者的比例（3∶1∶3）最佳。在生产实践中，可以选择银杏叶中三者组分含量比值为3∶1∶3的种质资源，其次是2∶1∶2（T4），具有进一步区试或推广。

3. 4 基于復配溶液抗氧化能力的非线性回归分析表明，槲皮素、异鼠李素配伍具有提高清除DPPH自由基清除能力的作用，而槲皮素与山奈酚、山奈酚与异鼠李素配伍均降低清除DPPH自由基清除能力;槲皮素、异鼠李素配伍具有削弱总还原力的作用，而槲皮素与山奈酚、山奈酚与异鼠李素配施提高总还原力。在复配研究中仅考虑了三者间的配比，未考虑两两之间的配比，同时缺少与单一组分同剂量的比较分析，需要进一步研究。

参考文献

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[8] 黄海波，  刘华春，  金朱明，  等.  银杏叶原花青素的制备及其抗氧化活性研究[J].  中国现代应用药学， 2016， 3（6）： 686 - 690.

[9] 宋唯唯，  刘芬芬，  刘彩红.  银杏叶提取物与其黄酮类物质抗氧化作用的比较[J].  泰山医学院学报，  2016， 37（5）： 484 - 486.

第1作者简介：  曹永富（1978-），  男，  高级工程师，  主要研究方向为林业科研和技术推广、  森林培育。

收稿日期： 2021 - 01 -  25

（责任编辑：   王 岩）

Antioxidant Effects of Main Components of Ginkgo

Biloba Flavonoids and Their Proportions

CAO Yongfu

（Linyi Forest Wetland Protection Center，  Shandong Linyi 276000）

Abstract The main results of the study on antioxidant ability of main components of quercetin， kaempferol， isorhamnetin and their complexe are as follows： （1）quercetin， kaempferol and isorhamnetin can effectively scavenge DPPH free radicals， and have a considerable total reducing power， and increase with the increase of concentration， with a dose effect; scavenging DPPH free radical energy The results showed that quercetin > kaempferol > isorhamnetin. （2）The ratio of the three main components significantly affected the total reducing power of the compound solution， among which T7 （3∶1∶3） and T4 （2∶1∶2） were two better combination treatments. （3）The combination of quercetin and isorhamnetin can improve the scavenging ability of DPPH free radical， while the combination of quercetin and kaempferol， kaempferol and isorhamnetin can reduce the scavenging ability of DPPH free radical; the combination of quercetin and isorhamnetin can weaken the total reducing power， while the combination of quercetin and kaempferol， kaempferol and isorhamnetin can increase the total reducing power.

Key words Ginkgo flavonoids;  Main component;  Complexe;  Antioxidant activity