安神补脑胶囊HPLC指纹图谱与3种成分含量测定方法研究

吴嫣艳，任会旭，冯友龙，张莉，张妤琳

(1.江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210019； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210023)

安神补脑胶囊为2019年国家评价性抽验品种，处方由鹿茸、制何首乌、淫羊藿、干姜、甘草、大枣、维生素B1组成，具有生精补髓、增强脑力的功效，用于神经衰弱、失眠、健忘、头晕[1-3]。本次抽样涉及的3个厂家分别执行国家食品药品监督管理局标准YBZ15322009、YBZ08452009、YBZ02542009，均仅有何首乌中所含的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量测定项，质控不够全面。本研究参考文献[4-13]建立了安神补脑胶囊的HPLC指纹图谱及测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸质量分数的方法，为该制剂的整体质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AB高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站(日本岛津公司)；BS21S 型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 试药

3个厂家的50批次安神补脑胶囊样品由国家药品评价性抽样中各省药监局提供；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批号110844-201814，质量分数91.0%)、淫羊藿苷(批号110737-201516，质量分数94.2%)、甘草酸铵(批号110731-201720，质量分数97.7%)、维生素B1(批号100390-201806，质量分数97.9%)、朝藿定C(批号111780-201804，质量分数92.6%)、大黄素(批号110756-201512，质量分数98.7%)均购自中国食品药品检定研究院；朝藿定A(批号R11N7F24698，质量分数98.0%)、朝藿定B(批号P25F8F30154，质量分数98.0%)、大黄素-8-β-D吡喃葡萄糖苷(批号P17A10F86138，质量分数98.0%)、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(批号P16N9F75128，质量分数96.0%)、淫羊藿次苷Ⅰ(批号YJ0628SA14，质量分数98.0%)、宝藿苷Ⅰ(批号R11M8F31212，质量分数98.0%)、大黄素甲醚(批号T09M9F55482，质量分数98.0%)均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、磷酸均为色谱纯，水为去离子水，其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵、维生素B1、朝藿定C、大黄素、朝藿定A、朝藿定B、大黄素-8-β-D吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿次苷Ⅰ、宝藿苷Ⅰ、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL分别含10 μg的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取胶囊内容物，研细，取约0.4 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超声处理30 min，取出，放冷，定容，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 采用ACE Excel C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；以乙腈为流动相A，以0.05 mol/L磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：270 nm；进样量：20 μL。

表1 HPLC指纹图谱梯度洗脱程序

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，精密吸取20 μL，按“2.1.3”项色谱条件进样测定6次，记录色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，测得相似度在0.998～1.000之间，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验 取同一批安神补脑胶囊，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，各精密吸取20 μL，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，记录色谱图，测得相似度在0.998～1.000之间，表明方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱图，测得相似度在0.999～1.000之间，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 特征峰归属 取10批安神补脑胶囊(厂家A 3批、厂家B 3批、厂家C 4批)按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，另吸取“2.1.1”项下对照品溶液，分别精密吸取20 μL，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，记录色谱图(见图1)，各色谱峰归属见表2。

注：各色谱峰归属见表2。

表2 安神补脑胶囊HPLC指纹图谱色谱峰归属

2.1.6 对照指纹图谱的生成 取“2.1.2”项下10批供试品溶液色谱图，以表2中所述13个峰为特征峰计算，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成对照指纹图谱，见图2。

2.1.7 相似度评价 取50批安神补脑胶囊，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，记录色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，以特征峰计算，结果相似度在0.962～0.997之间。

2.2 安神补脑胶囊中3种成分的测定

2.2.1 溶液的制备

2.2.1.1 混合对照品溶液 取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL分别含50、15、10 μg的混合对照品溶液，即得(甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.0207)。

图2 10批安神补脑胶囊指纹图谱与对照指纹图谱(R)的HPLC叠加图

2.2.1.2 供试品溶液 取内容物研细，取约0.4 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超声处理30 min，取出，放冷，定容，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.3 阴性对照溶液 按处方比例称取除制何首乌、淫羊藿、甘草以外的其他味药，按制备工艺制成不含制何首乌、淫羊藿、甘草的阴性供试品，按“2.2.1.2”项方法操作，制得不含制何首乌、淫羊藿、甘草的阴性对照溶液。

2.2.2 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05 mol/L磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱(洗脱程序见表3)；流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，PDA检测器；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷检测波长为320 nm，淫羊藿苷检测波长为270 nm，甘草酸铵检测波长为250 nm；进样量为10 μL。

表3 含量测定梯度洗脱程序

2.2.3 专属性试验 分别取“2.2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.2.2”项色谱条件下进样分析。结果显示理论塔板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰计算均大于5 000，阴性对照对测定无干扰，见图3。

A. 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品溶液320 nm； B.淫羊藿苷对照品溶液270 nm； C.甘草酸铵对照品溶液250 nm； D～F.供试品溶液320、270、250 nm； G～I.阴性对照溶液320、270、250 nm。

2.2.4 线性关系考察 精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵对照品适量，加稀乙醇制成浓度分别为0.2、1、2、10、40、80、100、200 μg/mL的标准系列溶液。按“2.2.2”项色谱条件进样测定，记录峰面积，以对照品的浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，结果得到：2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，y=35 296.910 7x+37 219.281 7，r=0.999 5，线性范围0.19～190.52 μg/mL；淫羊藿苷，y=20 624.461 9x+ 3 950.279 0，r=0.999 9，线性范围0.20～197.41 μg/mL；甘草酸(甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.0207)，y=8 175.735 2x+ 3.211 5，r=0.999 9，线性范围0.19～192.47 μg/mL。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.1”项混合对照品溶液，按“2.2.2”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果得到2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵峰面积的RSD值(n=6)分别为0.08%、0.10%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取批号为190120的样品，按“2.2.1”项方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，结果得到2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵质量分数的RSD值分别为1.40%、1.29%、1.70%，表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取“2.2.6”项下供试品溶液(批号190120)，在“2.2.2”项色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，记录峰面积。结果得到2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵峰面积的RSD值(n=8)分别为0.28%、0.25%、1.37%，表明方法稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量样品(批号190120)6份，每份精密称取0.2 g，置50 mL棕色量瓶中，精密加入混合对照溶液(2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵浓度分别为1.655 3、0.950 5、0.144 7 mg/mL)1 mL，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项色谱条件进样测定。结果测得2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵的平均加样回收率分别为100.04%、97.33%、97.00%，RSD(n=6)分别为1.43%、1.11%、1.23%，表明方法具有良好的准确性。

2.2.9 耐用性试验 取批号为1901072的样品，按“2.2.1”项下方法平行制备2份供试品溶液，按“2.2.2”项色谱条件进样分析，色谱柱分别采用Agela Durashell RP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent ZOBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、ACE Excel C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，结果显示理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰计算均大于5 000，分离度良好，3根色谱柱2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸铵质量分数RSD值分别为0.68%、0.50%、1.91%。

2.2.10 样品含量测定 取50批次安神补脑胶囊，按“2.2.1”项方法操作，制备供试品溶液各2份，按“2.2.2”项色谱条件测定，结果测得50批次安神补脑胶囊样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸的质量分数范围分别为2.4～4.8、0.24～1.96、0.04～0.49 mg/粒，见表4。

表4 各成分质量分数的测定结果

3 讨论

近年来，指纹图谱广泛应用于中药质量控制研究。本研究建立了安神补脑胶囊的HPLC法指纹图谱，并对50批次样品进行了筛查，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立了标准指纹图谱，考察样品的相似度，以期达到更全面地控制制剂整体质量的目的。

安神补脑胶囊由国家药品监督管理局《国家中成药标准汇编》(中成药地方标准上升国家标准部分)内科心系分册收载的“安神补脑片”改变剂型而来，方中制首乌补肝肾、益精血、养心安神，淫羊藿补肾阳、强筋骨，甘草则有调和诸药的功效。本文结合安神补脑胶囊处方制法，参考《中国药典》2015年版一部收栽的制何首乌、淫羊藿、甘草的含量测定项目[1]，分别选择2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3种成分建立含量测定方法，以有效控制安神补脑胶囊制剂质量。

对50批安神补脑胶囊样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸质量分数测定结果用SPSS软件进行统计分析，结果见图4。可见，淫羊藿苷与甘草酸2个成分的质量分数企业之间的差异较大。原法定质量标准中，均仅有何首乌中所含的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量测定项，而对淫羊藿与甘草酸没有进行控制。本文建立安神补脑胶囊HPLC指纹图谱，同时测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3种成分的质量分数，该方法准确、灵敏、可靠，为安神补脑胶囊的质量控制提供了依据，对原质量标准进行了提升。

A. 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷； B.淫羊藿苷； C.甘草酸)。