痰液结核分枝杆菌检测诊断肺结核①

马剑锋

(洛阳市涧西区疾病预防控制中心<传染病预防控制所>,河南 洛阳 471003)

肺结核是严重威胁人类生命健康的呼吸道传染性疾病,肺结核感染使机体的免疫能力减弱,免疫应答功能紊乱。在肺结核患病的早期进行诊断和治疗有利于患者康复,早期明确诊断、合理用药对改善肺结核患者的预后有意义[1-2]。因此,准确、可靠的诊断方法是关键[3]。笔者探讨细菌培养、涂片抗酸染色、荧光定量聚合酶链式反应(TB-PCR)与结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)检测肺结核的效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年3月至2019年3月洛阳市涧西区疾病预防控制中心收治的60例肺结核的患者,男38例,女22例;年龄30~70岁,平均(52.7±14.4)岁。患者病情符合肺结核诊断标准[2],无其他感染,无心、肺功能障碍。

1.2 方法

采集患者痰液样本,分别采用MTB培养法、涂片抗酸染色法、荧光定量聚合酶链式反应(TB-PCR)及结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)检测MTB。

1.2.1 仪器与试剂 酸性改良罗氏培养基,分枝杆菌(Middlebrook 7H9)培养基干粉(美国Becton Dickinson公司),抗酸染色试剂盒(济南百博生物技术股份有限公司),结核分枝杆菌PCR扩增试剂盒(上海宏锦公司);荧光定量PCR仪(美国应用生物公司)。

1.2.2 样本检测 ①MTB培养法:痰液标本高速离心5 min,洗涤沉淀后,接种于培养管;每60 min使用荧光强度记忆探测器检测培养管中的荧光强度。②涂片抗酸染色法:样本涂抹于玻片正中央,晾干,滴加2滴石碳酸复红染色液,夹持玻片在酒精灯上加热5 min,冷却后,冷水冲洗;滴加3%盐酸酒精脱色1 min,晾干后,冷水冲洗;滴加碱性美兰溶液进行复染,1 min后,冷水冲洗,晾干后,滴加香柏油,显微镜观察。③荧光定量TB-PCR:痰液标本加消化液液化30 min,高速低温离心,弃上清液,取沉淀加DNA提取液,充分混匀后,离心分离DNA;取适量DNA进行PCR扩增;计算机自动分析标本中的拷贝数。④Xpert MTB/RIF分析:按照Xpert MTB/RIF试剂盒说明书进行操作,痰液标本与NaOH及异丙醇处理液按1∶2混合,高速低温离心,取混合液2 ml转移至1次性多室塑料反应盒中,将反应盒放置检测模块进行分析。

1.3 结果判定

①MTB培养法:斜面有MTB菌落生长为阳性,反之则为阴性。②涂片抗酸染色法:显微镜下观察到抗酸杆菌,则判定为阳性,反之则为阴性。③荧光定量TB-PCR法:样本检测Ct值≤38,同时扩增曲线表现为S型,则判定为阳性;Ct值>38、≤40,需重复测定;如果Ct值仍为>38、≤40,同时扩增曲线表现为S型,则判定为阳性;如果Ct值≥40,则代表检测样本低于检测限,则判定为阴性[4]。④Xpert MTB/RIF法:反应结束后,在检测系统的窗口下,直接观察、判定结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件处理数据,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

60例肺结核患者痰液标本经MTB培养法、涂片抗酸染色法、荧光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法检测,MTB的检出率分别为56.7%、60.0%、83.3%和95.0%。Xpert MTB/RIF法的阳性检出率高于MTB培养法、涂片抗酸染色法和荧光定量TB-PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);荧光定量TB-PCR法的阳性检出率高于MTB培养法和涂片抗酸染色法(P<0.05);MTB培养法与涂片抗酸染色法比较,阳性检出率无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

肺结核是MTB感染肺的传染性疾病。MTB的菌体结构复杂,具有抗酸性能强、生长较缓慢、多形性且抵抗力高等特点,主要通过呼吸道感染;感染后,使肺泡以及支气管的上皮细胞丧失纤维黏素,呈现不同程度的肺部感染症状。可经消化道及皮肤黏膜破损处等途径感染机体,侵犯组织脏器,影响患者健康[5-7]。早期诊断MTB对积极开展治疗、改善预后均有重要意义。

肺结核的细菌学检查是诊断和确定肺结核的重要手段,对治疗结核病患者和阻止MTB传染有重要意义[8]。MTB培养法和涂片抗酸染色法是实验室细菌学检查最基本的方法,其中MTB培养法的敏感性、特异性及准确性均较高,被认为是临床诊断结核病的金标准,但MTB培养周期长,不利于结核病的早期诊断及治疗[9]。涂片抗酸染色法具有价廉、简便且快速等优势,但其诊断灵敏度较低。随着研究的深入和技术的进步,荧光定量TB-PCR法被逐渐应用于检测MTB[10-11],该检验手段主要是利用聚合酶链式反应及荧光定量技术对MTB基因进行检测,灵敏度和适用性较高,能快速做出诊断。Xpert MTB/RIF法是以全自动半巢式实时PCR技术为基础,利用对MTB特有的序列rpoB基因上与利福平耐药相关的81 bp的核心区间进行检测,能快速诊断患者是否感染MTB,以及是否对利福平耐药[12]。本研究结果显示,60例肺结核患者痰液标本经MTB培养法、涂片抗酸染色法、荧光定量TB-PCR法和Xpert MTB/RIF法检测,其阳性检出率存在明显差异,其中Xpert MTB/RIF法最灵敏,检出率达95.00%,与临床诊断极为接近;荧光定量TB-PCR法的阳性检出率为83.33%,显著高于MTB培养法和涂片抗酸染色法的56.67%、60.00%。提示Xpert MTB/RIF法对肺结核患者痰液标本MTB的阳性检出率最高。Pimkina等[13]研究发现,Xpert MTB/RIF在涂片抗酸染色体阳性、培养阳性和涂片阴性标本及培养阴性标本中检测出MTB高达97.8%和82.5%,说明肺结核患者行Xpert MTB/RIF检测对诊断和后续治疗均有较大帮助。此外,Xpert MTB/RIF检测集样品准备、扩增、检测为一体,自动化程度高,可同时检测多个样本,从标本处理至结果报告不超过2 h,比其他3种检测方法省时、省事。另外,Xpert MTB/RIF还能提供利福平耐药基因突变信息,为肺结核的快速诊断和治疗提供了重要参考[14]。

综上所述,应用不同方法检测肺结核患者痰液标本的MTB存在明显差异,4种检测方法中,以Xpert MTB/RIF的阳性检出率最高。因此,在肺结核诊断中,应综合多种途径进行诊断,避免漏诊,以便及早发现肺结核,改善患者预后。