人甲状腺癌小鼠移植性模型的抗癌治疗研究进展

程 冉，魏 枫

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院内分泌科，内蒙古 包头 014000)

1 甲状腺癌背景

甲状腺癌是内分泌系统中最为常见的恶性肿瘤，女性患者约占其中的75%。女性的全球发病率为10.2/10万，男性为3.1/10万[1]。在中国，女性甲状腺癌发病率位于女性癌症发病率的第四位，高达22.56/10万，是30岁以下女性发病率最高的恶性肿瘤[2]。与其他恶性肿瘤相比，甲状腺癌患者发病年龄在45至64岁之间，更为年轻。甲状腺癌分为分化型甲状腺癌(DTC)、甲状腺髓样癌(MTC)和间变性甲状腺癌(ATC)，DTC包括甲状腺乳头状癌(PTC)，甲状腺滤泡癌(FTC)和Hurthle细胞癌。其中，来源于滤泡上皮细胞的PTC最为常见，占新发病例的90%，且预后较好。MTC和ATC表现为缺乏分化和较高的转移倾向，恶性程度高，预后差。现阶段，DTC的治疗方法主要通过手术进行肿瘤切除，碘放射治疗通常作为术后患者的辅助治疗。其中约20%的患者术后复发，复发的甲状腺癌多为恶性。复发性DTC再次手术难度大，彻底清除率低，转移率增高，预后不良风险较大，可出现不同程度并发症[3]。

2 动物模型的建立

动物模型的建立根据不同疾病类型可选择合适的动物，诸如猴、狗、兔、鼠、鱼等。甲状腺癌动物模型分为自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型、基因工程小鼠模型与移植性小鼠模型四种，其中基因工程小鼠模型又包括转基因模型、基因剔除模型、基因替换模型及最新报道的限制性小鼠模型[4]。移植性小鼠模型通过将肿瘤细胞或者肿瘤组织接种到小鼠身体某部位使其生长，该方法现已广泛应用于多种癌症的动物模型建立。

3 人甲状腺癌小鼠移植性模型的抗癌治疗应用进展

由于术后甲状腺癌复发的患者再次手术难，复发肿瘤恶性程度高，转移率增加，所以，在药物的选择上，需要寻找更有效且对患者不良影响更小的药物，需要寻找出更为先进有效的治疗方法。在做实验性抗癌治疗中裸鼠移植性模型起到关键的作用。通过对甲状腺癌裸鼠移植性模型治疗演进的深入研究，探寻新的有效治疗方法，为临床治疗应用提供思路，指明方向。

3.1放疗:放射治疗通过电离辐射向身体输送能量，产生电离和自由基。电离辐射可造成细胞DNA中碱基丢失或碱基替换，氢键断裂，从而导致细胞死亡。除DNA外，辐射也可造成细胞膜通透性、酶活性和蛋白质结构的改变。高剂量的辐射可导致细胞线粒体衰竭和氧化、磷酸化受损使细胞立即死亡。在临床中，可通过应用电离辐射破坏肿瘤组织从而达到癌症治疗的目的。相对于正常组织，肿瘤组织更具异质性。由于肿瘤细胞的组成不同，组成肿瘤细胞的放射敏感性也不同，单一剂量的放射治疗效果局限。因此，在进行实验方案的选择时多选择联合治疗或分级治疗。

在Viktor Sandblom等的一项研究中，将患者来源的MTC肿瘤细胞(GOT2)植入4～5周龄雌性BALB/c裸鼠皮下，造模成功后其进行放疗和/或吉西他滨治疗。研究放射联合吉西他滨治疗MTC的潜在叠加或协同效应。放射治疗给予177Lu-octreotate或外放射治疗(EBRT)。结果显示接受EBRT和吉西他滨联合治疗的动物肿瘤体积减小最大。EBRT或吉西他滨的单药治疗也可使肿瘤体积减小，而接受177Lu-octreotate单项治疗的裸鼠与未接受治疗的裸鼠肿瘤差异不大。表明吉西他滨能使肿瘤细胞对辐射敏感，可明显增强放疗对GOT2的抗肿瘤作用。而此次实验中应用177Lu-octreotate单项治疗在本次实验中未能显现明显的抗肿瘤作用，可能与给药剂量过低，而GOT2肿瘤中生长抑素受体表达低有关。这提示，未来可评估研究使用177Lu-octreotate治疗高生长抑素受体表达的MTC，或是联合可提高肿瘤生长抑素受体表达的药物。在Viktor Sandblom等的进一步研究中，分别联合应用EBRT与两种酪氨酸激酶抑制剂Vandetanib和cabozantinib,在治疗开始两周后，与对照组相比，这些小鼠的肿瘤体积减少了约70～75%。联合治疗不仅能最大限度地缩小肿瘤体积外，还能延长肿瘤的进展时间。通过检测甲状腺癌细胞系中组织因子(TF)的表达，为ATC设计用64Cu放射标记生成的64Cu-NOTA-ALT-836依赖标志物，应用131I-ALT-836对ATC模型鼠放射免疫治疗(RIT)。结果显示131I-ALT-836 RIT可以显著延长ATC小鼠的生存时间，这种新治疗方法导致小部分肝细胞降解坏死，但未对其他主要脏器造成明显损伤。TF是一种很有前途的ATC生物标志物，今后可以使用64Cu-NOTA-ALT-836和131I-ALT-836的TF靶向治疗优化ATC在临床前的诊断和治疗。应用可以释放高能α粒子的放射性砹(211At)，并将211At溶液中加入抗坏血酸(AA)以提高其放射化学纯度，结果显示给与211At溶液注射组相比，AA处理后的211At溶液注射组动物甲状腺摄取明显增强。在小鼠异种移植瘤模型中，K1-NIS肿瘤在注射211At后，肿瘤生长立即受到抑制，且呈剂量依赖性，表明其潜在的适用性靶向α放射治疗。小剂量(0.1 MBq)的211At也能有效抑制肿瘤生长，但其再生速度比大剂量(0.4 MBq或1 MBq)快[5]。大剂量211At- NaAt可引起甲状腺癌小鼠移植瘤模型体内白细胞和淋巴细胞的短暂性减少、甲状腺萎缩和短暂性精子发育不良，但是没有严重的血液学或肾脏毒性，这表明分化性甲状腺癌的靶向α疗法的安全性是可耐受的。提示今后在临床应用靶向α放射治疗期间，可以进行更细分的给药，以减少正常器官的副作用。α射线的分级给药已成功应用于223Ra治疗去势抵抗性前列腺癌骨转移[6]。由此可见，211At的靶向α放射治疗在临床上是可行的，在未来我们应该对211At进行更深入的研究，作为一个很有希望的放射性物质，211At可以用于内源性或基因转移介导的NIS过表达的各种癌症治疗，为今后甲状腺癌靶向治疗提供新思路。

3.2化疗:化疗是化学药物治疗的简称，利用化学药物作用于肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，从而阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，最终达到抑制或杀死癌细胞目的的一种治疗方式。作为一种全身性治疗手段，化疗药物可杀灭肿瘤细胞，是肿瘤综合治疗中最主要的手段之一。化疗药物根据不同的作用机制可分为直接作用于DNA上防止癌细胞再生的烷化剂；通过干扰DNA和RNA合成的抗代谢药；通过抑制酶的作用和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA的抗肿瘤抗生素；通过抑制有丝分裂或酶的作用，从而防止细胞再生必需蛋白质合成的植物类抗癌药，均为植物碱和天然产品；利用激素杀死癌细胞或减缓癌细胞生长时，也可把它们看成化疗药物。

传统的细胞毒性化疗药物，如阿霉素(DOX)和紫杉醇，具有高毒性，ATC患者对阿霉素的耐药性集中，导致预后恶化[7]。而白藜芦醇能有效抑制多西紫杉醇/阿霉素耐药ATC细胞的生长，以ATC为靶点的缓释白藜芦醇纳米颗粒显著提高体内抗ATC的效果[8]。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇在治疗ATC特别是化疗耐药的ATC中具有临床价值，为白藜芦醇用于ATC和其他类型癌症的临床治疗提供了一种潜在的途径。为了克服ATC耐药问题，Han X通过合成负载DOX的介孔有机硅纳米颗粒(MONPs)，并用牛血清白蛋白(BSA)稳定纳米复合材料。结果表明BSA-Dox-MONPs可以通过增加药物摄取和抑制药物流出两种方式逆转ATC细胞化疗耐药，为化疗耐药ATC的治疗提供了一个有前景的平台。转录抑制因子Slug可抑制化疗药物诱导的癌细胞凋亡。在Yinghua Pan等的一项实验中，评估了靶向Slug是否能增强阿霉素诱导的ATC细胞凋亡。研究结果表明，Slug基因敲除对SW1736细胞的生长有显著的抑制作用，可诱导p53正向凋亡调节因子上调增加DOX在SW1736细胞中的抗肿瘤活性，促进细胞凋亡抑制肿瘤生长，而过表达Slug则增加化疗耐药性[9]。维生素C是人体必需的营养物质，需要外源性补充。Gulo/小鼠是维生素C研究的理想候选对象，因为它们和人类一样，不能在肝脏中合成[10]。大剂量维生素C可以通过活性氧(ROX)依赖机制抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT通路杀死甲状腺癌细胞，抑制小鼠模型中肿瘤的生长速度[11]。维生素C可以通过多种分子机制对甲状腺癌细胞起到杀伤作用，不失为一种安全有效的抗甲状腺癌药物，为将来与其他常规或靶向治疗相结合的治疗方法提供了理论基础。Anlotinib是一种新型的多激酶抑制剂，在临床前模型中已显示出对多种肿瘤的疗效。应用Anlotinib对乳头状甲状腺癌裸鼠模型治疗可以显著降低肿瘤重量和肿瘤体积，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，且基本不影响小鼠的体重[12]。Anlotinib作为一种新型有效的抗肿瘤药物，可在未来应用于甲状腺癌的治疗，特别是对于目前尚无有效治疗方法的低分化甲状腺乳头状癌和ATC。阿帕替尼是一种血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的小分子抑制剂，可在多种肿瘤中诱导细胞凋亡并抑制肿瘤增殖。在KHM-5M异种移植瘤模型中，阿帕替尼可以通过AKT/mTOR通路下调p-AKT和p-mTOR信号，诱导ATC细胞自噬和凋亡，联合使用阿帕替尼和自噬抑制剂氯喹可产生额外的肿瘤抑制，使肿瘤体积缩小，抑制肿瘤细胞增殖，具有更强的抗肿瘤作用。这些发现证实了阿帕替尼靶向自噬可能是一种很有前途的ATC治疗策略，ATC患者可能受益于这种新的抗癌药物。Soo YK等通过应用索拉非尼和伦瓦替尼进行交替治疗难治性甲状腺癌，在异种移植模型中，索拉非尼或伦瓦替尼单独治疗并不能显著抑制患者来源的侵袭性PTC细胞异种移植肿瘤，而交替治疗则能显著抑制这些裸鼠体内肿瘤的增殖[13]。这为今后临床治疗甲状腺癌患者的治疗方案提供了新的思路。Flavopiridol是CDKs的一个有效的选择性抑制剂，而CDKs是调节细胞周期的蛋白激酶的一员，在转录、mRNA加工和细胞分化中发挥重要作用。Flavopiridol可使细胞周期蛋白CDK9和MCL1水平下降，并诱导细胞周期阻滞，阻碍迁移。在患者来源的ATC小鼠移植模型中，Flavopiridol也可使肿瘤重量下降，体积缩小[14]。Flavopiridol对ATC的作用机制还需要做进一步的研究，来提高对该药物的临床有效性的认识，以延缓疾病进展和改善患者的整体预后。

3.3免疫治疗:免疫治疗是现阶段研究的热点之一，肿瘤的免疫治疗是指免疫制剂通过不同的给药途径进入人体内，从而激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。其不同于手术、放化疗，不针对肿瘤细胞和组织，而是通过刺激人自身的免疫系统，更加高效地识别杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。该方法已在多种类型的肿瘤治疗当中取得很好的疗效，一般须同手术、放疗或化疗配合应用。有大量研究资料表明，裸鼠虽然胸腺缺失，缺乏T淋巴细胞，但是仍具有产生巨噬细胞、浆细胞、抗体及NK细胞活性的免疫反应。因此对裸鼠肿瘤模型进行免疫治疗研究，可更好地解释某些免疫治疗的作用机制。

CAR-T细胞作为一种新的治疗模式正在被开发，用于许多不同类型的现有治疗方法难以治愈的癌症，例如在特定的血液系统恶性治疗中取得了令人印象深刻的成就，但由于在实体肿瘤环境中缺乏靶向抗原，CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用受到一定限制[15]。Yogindra Vedvyas等通过处理靶向ICAM-1的CAR-T细胞，随后注射到ATC模型小鼠体内，大剂量的CAR-T细胞治疗能快速并且彻底地根除肿瘤，缓解时间更长，显著提高生存率[16]。这提示，在未来可据此设计治疗方案，将其应用于治疗间变性甲状腺癌和难治性或复发性侵袭性甲状腺癌的患者。溶瘤病毒疗法(OVT)是一种很有前途的癌症免疫治疗方法。溶瘤病毒(OVs)通过提高疗效、利用免疫刺激成分、将免疫抑制肿瘤微环境(TME)改变为炎性TME、优化其传递系统、提高治疗安全性。其中Oncorine(H101腺病毒)和T-VEC或Imlygic(HSV-1)，已分别批准用于头颈部肿瘤与黑色素瘤。通过联合BRAF抑制剂与溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)治疗ATC荷瘤小鼠，可以创造一个更有利的肿瘤免疫微环境，促进肿瘤的炎症状态，显著提高了ATC模型小鼠的生存率。通过oHSV驱动免疫，可改善BRAF抑制剂治疗效果。肿瘤细胞中可以表达程序性死亡配体(PD-L1)，它作为一种新兴的生物标志物，在抗肿瘤免疫治疗中同样具有非常重要的作用。相当比例的人TC样本在上皮性甲状腺癌细胞上表达PD-1，PD-1的表达水平与TC的肿瘤分期和淋巴结转移相关，其活性还可诱导TC细胞的增殖和运动，并发挥内在的促肿瘤功能。因此甲状腺癌或其他类型的癌症，可以受益于免疫检查抑制点(ICI)的双重作用：重新激活免疫抗肿瘤反应和直接对抗癌细胞的增殖作用。在癌细胞和肿瘤微环境中定义免疫检查点的功能和生化活性，将扩大我们的知识，使我们能够开发合理的治疗策略，积极利用ICI结合SHP2或RTK/Ras/MAPK抑制剂。但在治疗各种恶性肿瘤时，ICI经常发生免疫相关不良事件(irAEs)，因此寻找甲状腺irAE的生物标志物尤为重要。其中甲状腺球蛋白、甲状腺自身免疫和细胞因子水平的早期变化可能与甲状腺irAE的发展有关。这些因子可以作为肿瘤治疗的替代生物标志物有潜在的应用前景。

4 小结与展望

对甲状腺癌的关键基因进行靶向治疗时，可以采用不同化疗药物之间联合或与放射治疗联合等方案，显著提高治疗效果，降低不良反应的发生。此外不同的给药方式给药途径均可影响药物的抗肿瘤作用，研究有更高的细胞摄取选择性和抗肿瘤活性新的肿瘤靶向给药系统，尽可能减少荷瘤小鼠主要器官的损伤。在未来的临床应用中，才能最大程度降低甲状腺癌患者的复发率、死亡率，提高生存率。相对于体外实验，体内实验更直观，可在一定程度上观察药物的不良反应。而目前建立的各种甲状腺癌动物模型，都有各自的优缺点。因此，要根据实验研究内容选择适当的动物模型。基于甲状腺癌小鼠移植模型水平的动物实验可为临床治疗提供实验依据，但在研究过程中需要重视动物模型与人甲状腺癌存在着的固有差异，该模型不能完全模拟人甲状腺癌的全部特征，移植性模型甲状腺癌小鼠实验结果与临床应用之间，还有很长的路要走，不仅需要合理的实验设计还需要更深入的研究。