血清LncRNA-XIST在慢性心力衰竭患者中表达及临床价值

刘旭帮，张朝华，魏娟玲，赵信科

慢性心力衰竭（CHF）是血流动力学负荷过重、心肌病及心肌梗死等多种心血管疾病的终末阶段，疗效差，死亡率高，严重威胁人类健康[1]。有数据统计，全球有2250万CHF患者，且仍以每年200万速度增长；而我国作为人口大国，且老年人口占比大，CHF患者人数已接近400万，死亡人数高达60万[2]。近年，医学技术发展迅速，CHF诊断方法也由最初的X线检查（心胸比）到血清N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）及彩色多普勒心脏超声仪检测，其灵敏度和精确度均有所升高，但其治疗方式仍以改善症状为主，对预后仍无明显价值，故认为寻找特异性和灵敏性更高的血液指标以尽早明确诊断并精确评估CHF患者状态，甚至逆转心脏重构是未来几年甚至几十年所有心血管学者们的主要研究方向[3-6]。长链非编码RNA（LncRNA）是一种长度超过200nt但不编码蛋白的RNA，起初多被认为是基因组转录“垃圾”，是RNA聚合酶Ⅱ转录副产物，不具备生物学功能；后来随着研究的不断深入，其功能逐渐清晰，与表观遗传、转录及转录后基因表达密切相关，在人类疾病发生发展过程中占重要地位[7,8]。目前，关于LncRNA与肿瘤发生发展的研究较多且具有一定价值，但与心血管疾病较少，有待挖掘，为心血管患者诊疗提供更多可能[9,10]。本研究前期通过基因芯片发现CHF患者血清中长链非编码RNA-XIST（LncRNA-XIST）高表达，提示其可能参与CHF发生发展。本研究选取2016年6月～2018年6月于郑州人民医院诊治的108例CHF患者和50例健康体检者作为研究对象，探讨血清长链非编码RNA-XIST（LncRNAXIST）在CHF中的表达情况，分析其临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2016年6月～2018年6月于郑州人民医院诊治的108例CHF患者作为研究对象，命名为CHF组，其中男性62例，女性46例；年龄40～70岁，平均（60.14±5.38）岁；病程1～6年，平均（4.28±1.62）年；根据美国纽约心脏协会（NYHA）心功能分级：NYHA Ⅰ级32例、NYHA Ⅱ级34例、NYHA Ⅲ级22例和NYHA Ⅳ级20例。纳入标准：①临床表现及辅助检查符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[11]中CHF诊断者；②NYHA Ⅰ～Ⅳ级；③依从性良好者；排除标准：①心肌梗死、急性感染、创伤等所致急性心力衰竭者；②合并恶性肿瘤者；③合并严重肝肾功能损伤及代谢性疾病者。选取同期50例健康体检者作为对照，命名为对照组，其中男性28例，女性22例，年龄42～68岁，平均年龄（59.54±5.17）岁。所有研究对象均签署知情同意书，并通过伦理委员会批准。两组在性别及年龄等一般资料上，差异无统计学意义（χ2=0.028，P=0.868；t=0.660，P=0.510），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集抽取两组患者入组第1 d空腹静脉血5 ml于黄色血清管中，充分混匀，静置10 min，4000 r/min离心5 min，留取上清液，-80℃冰箱保存，待检测。

1.2.2 血清LncRNA-XIST检测本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）进行检测，具体步骤如下：严格参照试剂盒说明书完成总RNA的提取和cDNA合成，后进行FQ-PCR检测：以适量cDNA作模板，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参，配置PCR反应体系，在美国ABI公司实时荧光定量PCR检测仪上进行检测及分析，LncRNAXIST相对表达水平以2-△△Ct表示，其中△△Ct=△CtCHF组-平均△Ct对照组，△Ct=目的基因（LncRNAXIST）Ct值-内参基因（GAPDH）Ct值。XIST引物序列：F：GCATGGGTGACCACCAGAAA（5’-3’）；R：AGCAACCAACTCCCCAGTTT（5’-3’）。

1.2.3 其它检测本研究采用化学发光免疫法进行检测血清NT-proBNP，具体参照美国雅培公司i2000全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂进行检测。采用荷兰飞利浦公司IE33彩色多普勒超声仪检测CHF患者心脏左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室射血分数（LVEF）。

1.3 随访CHF患者出院（标准：NYHA心功能分级为Ⅰ～Ⅱ级或LVEF＞35%）后随访1年，截止日期2019年6月，期间每3个月复诊1次，须重新评估NYHA心功能和行心脏彩超检查等，以判断心脏事件发生情况。其中心脏事件是指心力衰竭进展（NYHA心功能分级进展为Ⅲ～Ⅳ级或LVEF＜35%）、心力衰竭急性加重再次住院及心源性死亡者等，心脏事件发生即为随访中断。随访期间仍须参照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》规律用药。

1.4 统计学方法本研究所有数据均用SPSS 20.0统计学软件进行分析，其中计量资料用（±s）表示，用t检验进行比较；用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清LncRNA-XIST对CHF的诊断价值；用Pearson法分析LncRNA-XIST与NTproBNP、LVEF和LVEDD之间的关系；用logistic回归法探讨影响CHF预后的独立危险因素；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清LncRNA-XIST水平比较CHF组和对照组血清LncRNA-XIST水平分别为5.52±1.25和1.24±0.18，两组比较差异有统计学意义（t=24.056，P=0.000）。

2.2 血清LncRNA-XIST对CHF的诊断价值采用ROC曲线图分析血清LncRNA-XIST诊断CHF的敏感性及特异性，其中ROC曲线下面积为0.925（0.814～1.000），其截断值为3.92，此时敏感性为80.0%，特异性为92.0%，图1。

2.3 CHF患者血清LncRNA-XIST与NYHA心功能分级的关系在CHF患者中，NYHA心功能（Ⅲ+Ⅳ级）者血清LncRNA-XIST高于NYHA心功能（Ⅰ+Ⅱ级）者，差异有统计学意义（t=7.871，P=0.000），表1。

图1 血清LncRNA-XIST诊断CHF的ROC曲线图

表1 CHF患者血清LncRNA-XIST与NYHA心功能分级的关系（±s）

表1 CHF患者血清LncRNA-XIST与NYHA心功能分级的关系（±s）

NYHA心功能分级 例数 LncRNA-XISTⅠ+Ⅱ级 66 3.78±1.16Ⅲ+Ⅳ级 42 6.05±1.84 t值 - 7.871 P值 - 0.000

2.4 CHF患者血清LncRNA-XIST与NT-proBNP、LVEF和LVEDD之间的关系经Pearson法分析得知，CHF患者血清LncRNA-XIST与NT-proBNP和LVEDD呈明显正相关（r=0.785，P=0.001；r=0.692，P=0.009），而血清LncRNA-XIST与LVEF呈明显负相关（r=-0.576，P=0.016）。

2.5 CHF预后的独立危险因素分析经logistic回归分析得知，病程≥5年、心功能分级（Ⅲ+Ⅳ级）和血清LncRNA-XIST≥5.52是导致CHF心脏事件发生的独立危险因素（P＜0.05），表2～3。

表2 赋值表

表3 影响CHF预后独立危险因素的logistic回归分析

3 讨论

近年，随生活水平不断提高，人们饮食及生活方式随之改变，高血压、冠心病及糖尿病等疾病罹患率明显升高，而以上疾病进展到最后均可发展成为心力衰竭，住院率及死亡率较高，严重者5年存活率不超过20%，已引起临床工作者和患者的重视，寻找敏感并且特异有效指标迫在眉睫[12,13]。血清NT-proBNP是目前临床心力衰竭诊断最常见的血液学检测指标，易受肾功能影响而出现假性升高，此外，其还可受人口学特征、药物、非心力衰竭疾病及心力衰竭并发症等影响，敏感性及特异性有待考量[14]。LncRNA是近年研究的热点之一，在肿瘤中研究较多，且逐步向临床应用转化；而其在心血管疾病中的研究则起步较晚，但目前也发现部分LncRNA与心脏发育、高血压、冠心病及心脏衰竭等密切相关[15,16]。2006年Ishii等[17]研究发现LncRNA-MIAT可作为心肌梗死的敏感点，在ST段抬高中明显高于非ST段抬高者。后随研究深入，Liao等[18]发现LncRNAMIAT可通过miR-150-5p介导VEGF信号通路参与心肌梗死的发生。X-非活性特异转录物（XIST）是胎盘哺乳动物X染色体上的一个RNA基因，在X失活过程中占主导地位，位于人X染色体q13.2上；目前研究显示LncRNA-XIST与人类肺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌及宫颈癌等恶性肿瘤相关，但关于其在CHF患者血清中的表达情况及意义目前报道较少，具有一定创新价值[19,20]。

本研究采用FQ-PCR检测108例CHF患者和50例健康体检者中血清LncRNA-XIST表达情况发现，CHF患者LncRNA-XIST水平高于健康体检者，提示血清LncRNA-XIST水平与CHF相关，有可能成为CHF诊断指标。与前述研究不同，本研究更重视临床价值探讨。为此本研究通过绘制ROC曲线进行验证，发现血清LncRNA-XIST诊断CHF的ROC曲线下面积为0.925（0.814～1.000），其截断值为3.92，此时敏感性为80.0%，特异性为92.0%，明确了血清LncRNA-XIST在CHF中的诊断价值，更加完善了CHF患者诊疗体系，为本文一重要创新点。对于CHF患者，心功能分级十分重要，分级不同，诊疗及预后不尽相同。故本研究随后又比较了不同NYHA分级患者血清LncRNA-XIS差异发现心功能Ⅲ～Ⅳ级患者者血清LncRNA-XIST高于心功能Ⅰ～Ⅱ级者，说明心功能分级越高，血清LncRNA-XIST水平越高，提示血清LncRNA-XIST水平对CHF患者心功能状态评估亦具有一定价值，提升了其在CHF中的应用价值，以供临床使用。此后本研究还采用Pearson法探讨了血清LncRNA-XIST与NT-proBNP、LVEF和LVEDD之间的关系发现血清LncRNA-XIST与NTproBNP和LVEDD呈明显正相关，而与LVEF呈明显负相关，说明血清LncRNA-XIST水平越高，其NT-proBNP和LVEDD越高，而LVEF则越低，可间接反映心力衰竭严重程度，但具体作用机制尚不清楚，有待后续继续探讨。最后，本研究还采用logistic回归分析法探讨影响CHF预后的独立危险因素发现，病程≥5年、心功能分级（Ⅲ+Ⅳ级）和血清LncRNA-XIST≥5.52是导致CHF心脏事件发生的独立危险因素（P＜0.05），再次突出了LncRNA-XIST对CHF患者的临床价值。

综上认为，血清LncRNA-XIST在CHF患者中高表达，NYHA心功能分级越高，其值越大，有望成为CHF诊断及预后评估的有效指标之一。