外泌体在乳腺癌中的研究进展

徐家菡 姚永忠

南京医科大学鼓楼临床医学院，江苏南京 210000

全球范围内，乳腺癌的发病率和死亡率占所有癌症的11.6%和6.6%，是女性中最常见的癌症[1]。绝大部分乳腺癌患者死亡是由肿瘤转移和复发导致重要脏器功能衰竭造成的，因此寻求有效的诊疗和预后指标来攻克这个难题有利于解决乳腺癌患者的生存质量并延长生存时间。近年来已有证据表明，外泌体作为一种细胞间通讯的重要和成熟的介质，调节细胞功能和组织稳态[2-4]，因其能够通过向受体细胞释放其遗传和分子物质来进行短距离和远距离的通信，深刻影响细胞的多种生物学功能及癌症的发展，受到越来越多的关注[5-6]。

1 外泌体的特征

1.1 外泌体结构和内容物

外泌体是大小为30～150 nm 的内吞膜小泡，具有双层脂质结构，可携带大量的核酸、蛋白质和脂类释放到胞质外。目前外泌体中已发现了多种核酸，如MicroRNAs（miRNAs）、mRNAs、核糖体RNA 和小核RNA、小核仁RNA 和长非编码RNA，这些核酸可以被整合到受体细胞中，参与细胞多种生物学功能的调控。

1.2 外泌体的生物发生

外泌体的发生始于内质体系统，早期的内质体成熟后，形成后期的内质体或多泡小体（multivesicular bodies，MVBs），内质体膜向内出芽形成细胞器内腔小泡。形成MVBs 的方式分为两种：一种是依赖于内吞体分选转运复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的形成方式，另一种非依赖性的ESCRT 的形成方式[7]。

外泌体生物发生在癌症中是紊乱的，人肿瘤细胞系B42 的外泌体释放量明显高于亲代正常乳腺上皮细胞HMEC B42[8-9]。脂肪因子瘦素可能是促进乳腺癌释放外泌体的一个重要因素，因为瘦素/瘦素受体轴可与热休克蛋白90 相互作用，能诱导肿瘤易感基因101 的蛋白表达，激活依赖于ESCRT 的MVBs 形成通路，从而导致乳腺癌细胞多囊泡体MVB 形成和胞外泌体分泌增加[10]。

2 外泌体在乳腺癌发生、发展中的作用

肿瘤微环境是肿瘤形成的关键因素，肿瘤细胞可通过与其微环境相互作用从而促进肿瘤的发生、发展。外泌体被认为是肿瘤微环境中细胞与细胞之间相互作用的主要媒介，参与促进肿瘤细胞侵袭、血管生成和免疫抑制[11]。有研究表明，胃癌细胞分泌的外泌体可通过激活TGF-β/Smad 通路，调控其微环境的形成，从而促进肿瘤的发生、浸润及转移[12]。另有文献报道，肝癌细胞通过IGF1 来抑制邻近细胞产生miR-122，调节微环境，促进肝癌细胞增殖[13]。

2.1 外泌体对乳腺癌细胞侵袭的影响

乳腺癌细胞释放的外泌体中含有调节细胞骨架重构、增强侵袭能力的蛋白质、miRNAs 和信号分子[14]。对非转移性和转移性小鼠乳腺癌细胞系中分离的外泌体进行比较分析，发现转移性细胞分泌的外泌体中包含一组独特的膜蛋白，即铜蓝蛋白、异黏蛋白，可以降解增强细胞迁移和侵袭能力的蛋白，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、膜蛋白Caveolin-1 及其他黏附相关蛋白[15-16]。除了蛋白质外，乳腺癌细胞系和乳腺癌患者的外泌体内存在miRNAs，并且创建了EVs miRNA 数据库[17-18]。例如，HER2 阳性和三阴性乳腺癌患者外泌体中miRNAs 特定的表达模式已被证实与临床病理、危险因素和侵袭性显著相关[18]。高度转移性的MDA-MB-231 细胞的miRNAs 可诱导非转移性MCF-7 细胞恶变并增强其迁移能力[19]。此外，不同的体细胞与乳腺癌细胞相互作用后，可通过分泌多种可溶性因子来促进乳腺癌的发生、发展。据报道，巨噬细胞被白细胞介素-4 激活后通过βcatenin 途径分泌含miR-223 的外泌体，miR-223 进入MDA-MB 乳腺癌细胞后促进了乳腺癌细胞的侵袭[20]。外泌体也可以通过诱导MCF-7 细胞侵袭促进乳腺癌细胞迁移[21]。

2.2 血管生成

肿瘤原发灶形成新的血管为肿瘤细胞的生长和扩散提供了更多的营养。乳腺癌细胞分泌的外泌体可以通过激活内皮细胞促进新血管的形成。外泌体膜联蛋白A2（Annexin A2）是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，可促进tPA 依赖的血管生成，若外泌体中缺失Annexin A2，乳腺癌发生脑转移和肺转移的风险明显降低[22]。乳腺癌患者血清中Annexin A2 的表达明显高于非癌症患者，尤其是在三阴性乳腺癌女性中表达量最高，此外，体内基质凝胶塞试验显示TNBC 的外泌体中Annexin A2 可促进血管生成[23]。肿瘤内缺氧可以驱动乳腺癌新生血管的生成，缺氧条件下释放的外泌体含有大量miR-210，它可以促进内皮细胞存活，迁移和分化，并且促进毛细血管的形成[24]。

2.3 免疫抑制

逃避免疫监视是肿瘤获得转移性生长的关键步骤。研究结果表明，外泌体可以通过多种机制帮助乳腺癌细胞发挥免疫逃逸作用，例如有研究称乳腺癌细胞在复制过程中，释放了含miR-503 的外泌体，外泌体通过STAT3 和NF-κB 途径促进小胶质细胞M1 到M2 的转化，诱导T 细胞增殖的抑制[25-27]。事实上，巨噬细胞活动的免疫调节是乳腺癌细胞促进转移的一个重要机制。乳腺癌分泌的外泌体刺激巨噬细胞的NFκB 活化，从而产生促炎症细胞因子，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、粒细胞集落刺激因子和CCL2。这一过程需要激活巨噬细胞中的Toll 样受体2，并受外泌体表面棕榈酰化蛋白配体的影响[28]。CTCs 在循环系统中可以自我保护并诱导血小板聚集，除了避免免疫系统的监视外，还可以促进远处靶器官的外渗和阻滞。

2.4 外泌体在肿瘤微环境中的作用

作为转移过程的最后一步，CTCs 在血液压力、失巢和循环中的宿主免疫反应中幸存下来并到达远处的靶器官。外泌体通过改变非转化细胞的代谢和/或培养宿主肿瘤微环境中的细胞（如内皮祖细胞、间充质细胞和骨髓源性细胞）来驱动癌细胞的器官转移，建立允许迁移的环境条件[29]。外泌体可以通过影响血管系统的通透性、CTCs 与血管内壁的黏附和外渗，来影响乳腺癌细胞定植部位。例如，转移性乳腺癌细胞分泌的外泌体中的miR-105，通过靶向紧密连接蛋白ZO-1 有效破坏内皮屏障的完整性，显著增加肺和脑的体内转移，且与无瘤动物比较，携带肿瘤动物的循环miR-105 显著升高，miR-105 在发生远处转移的乳腺癌患者的血清中的含量显著高于未发生转移的乳腺癌患者[30]。到达靶器官的CTCs 需要在远处的靶器官中找到一个合适的微环境形成肿瘤肿块。对乳腺癌细胞分泌的外泌体研究发现，该外泌体可诱导肺成纤维细胞增殖和迁移，高通量测序分析发现乳腺癌细胞分泌的外泌体中的长非编码RNA 异常表达，推测外泌体LncRNA 促进了肿瘤转移微环境的建立[31]。

3 外泌体的临床价值

外泌体存在于各种生物体液中，由于外泌体在细胞间通讯和肿瘤发生中扮演重要角色，因此有潜力成为乳腺癌的非侵入性诊断和预后判断的工具以及治疗的靶向。

3.1 外泌体在乳腺癌诊断中的应用

外泌体可以在生物体液中获取，且其中包含了大量的肿瘤信息。Hannafon 等[32]研究显示，循环外泌体miRNA-21 和miRNA-1246 在乳腺癌患者中大量存在，可被用作乳腺癌的潜在诊断生物标志物[32]。此外，乳腺癌患者的胸腔积液/血清外泌体中ADAM10（一种金属蛋白酶）、CD9、Annexin-1 和HSP70 的含量特别高[33]，因此这些外泌体蛋白同样有作为乳腺癌诊断/预后的生物标志物的潜能。此外，乳腺癌患者血清外泌体中Survivin-2B 的不同表达模式可作为早期乳腺癌患者的生物标志物[34]。

3.2 外泌体在乳腺癌治疗的应用

外泌体是免疫原性较低的天然载体，可以将各种分子传递到远程目标，甚至能穿过血脑屏障，外泌体还能够介导细胞信号，传输许多生物分子，因此有潜力用于多种疾病的治疗[35]。在一项研究中，采用超声波或电穿孔技术，将外源性小干扰RNA、miRNA 和单链DNA 寡核苷酸装载到外泌体内，这些改造过的外泌体可通过沉默受体细胞中的HER2 基因来诱导抗癌特性[36]。紫杉醇作为一种化疗药物，在与MSCs 孵育后可以被分为组装进外泌体。与未经处理细胞的外泌体相比，载紫杉醇的外泌体能有效抑制癌变[37]。因此，外泌体可以作为纳米载体用于治疗目的，但是还需要进一步的研究来阐明这些方法的有效性和可行性。

4 小结

乳腺癌仍然被认为是一种不治之症，需要新的早期诊断工具和更多的治疗选择。外泌体在癌症中起着关键作用，有潜力成为肿瘤抑制的靶点。由于外泌体存在于大多数生物体液中，因此，也有潜力作为乳腺癌诊断/预后的生物标志物。然而，基于外泌体的研究尚处于起步阶段，大部分研究是在临床前模型中进行，而外泌体在乳腺癌相关临床试验中的特异性和有效性尚未报道。因此进一步的研究对于阐明外泌体在乳腺癌发展中的确切作用至关重要。总的来说，乳腺癌外泌体是一个有吸引力的研究领域，可以为乳腺癌的预防、诊断和治疗提供新的机会。