中药材种子种苗真实性鉴定技术研究进展△

赵莎，郑司浩，曾燕，戴玮，李鹏英，王继永

中国中药有限公司，北京 100195

中药材种子种苗是中药材生产的物质基础，是中药大健康全产业链的起点，也是《中共中央国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》中“加强中药材质量控制”的关键点。当前，市场上中药材种子种苗质量参差不齐，存在种源混杂、以假充真等问题[1]，特别是野生资源紧缺、市场价值高的中药材品种，已成为种子种苗掺伪的重灾区[2]。因部分中药材种子体积较小、肉眼难以分辨、正品及其混伪品外观性状相似等原因，导致中药材种子种苗真实性鉴定难度增加。另外，因从业者对中药材种子种苗真实性鉴定不够重视或缺乏专业的鉴定知识，容易造成鉴定错误。一旦种子种苗真实性鉴定错误，将给药农带来不可弥补的经济损失，给临床用药安全带来隐患。中药材种子种苗真实性鉴定错误已是中药材市场混乱的重要原因[2]。例如，柴胡资源在我国分布广泛，市售柴胡种子存在品种多样、来源不确定和质量不稳定等问题，极不利于“有效、优质、稳定、可控”的柴胡药材生产[3]。陈美君[4]发现，从农户、小型种植基地或白及种苗公司采集的白及样品为黄花白及或小白及，可见白及药材在栽培种植源头就已出现基原混乱的现象。因此，保证中药材种子种苗基原准确对把控好中药材生产的源头至关重要。

1 中药材种子种苗真实性鉴定技术

种子真实性是指一批种子的特性，供检品种与文件记录（如标签等）是否相符，即品种是否名副其实[5]。种子真实性是衡量种子质量的重要指标之一。目前，中药材种子种苗真实性鉴定方法主要有性状鉴定、显微鉴定、理化分析鉴定、分子鉴定等。

1.1 性状鉴定

性状鉴定包括传统性状鉴定及微性状鉴定。传统性状鉴定主要是通过观察中药材种子形状、大小、颜色、表面纹理等典型特征进行鉴定；微性状鉴定是通过观察中药材种子表面的细微特征，根据表面反映出的不同信息特征达到鉴定中药材种子的目的[6-7]。后者与前者没有本质的区别，是前者向着微观领域的延伸。

1.1.1 传统性状鉴定 由于不同物种遗传基础不同，种子形态和内部结构常呈现稳定的差异，通过对这种稳定的差异（如种子的形状、大小、颜色、种皮表面纹饰）进行观察统计可区分和界定不同物种[1]。《实用中药种子技术手册》《中国药用植物种子原色图鉴》均较为直观地提供了各种子的基本特征，为后续深入研究提供了依据[8-9]。需要注意的是，应用传统性状特征进行鉴定，需建立种子标本实物库和信息库，为种子鉴定提供详细的实物和数据信息。

1.1.2 微性状鉴定 微性状鉴定一般借助放大镜、扫描仪及低倍显微仪器等来分析观察，具有简单、快速、廉价的优点[10]。韦颖[6]通过研究比较了105 种药用植物果实和种子的性状、微性状及显微结构，为中药材果实、种子的真伪鉴别提供依据。高飞燕[11]对种子类中药微性状进行研究发现，不同种子表面一般都有不同的微性状特征，可作为微性状鉴别依据。王军等[12]在鉴别南鹤虱、小茴香、肉豆蔻3 种果实种子类药材时，在采用传统性状鉴别方法的同时结合微性状鉴别方法，更好地将药材与其伪品进行区分鉴别。胡文璐等[13]采用中药微性状鉴定法对21 批车前子正品和7 种车前子伪品进行观察比较，结果显示，车前子正品与伪品的微性状区别明显。王雪利等[14]对紫苏子及其混伪品表面的微性状特征进行观察和研究，并利用中药微性状鉴定法成功对其进行真伪鉴别。

1.2 显微鉴定

种子的显微鉴别是指通过显微镜观察中药材种子的显微结构，根据不同物种表现出的不同显微特征进行鉴定。种皮的表面形态、结构、组成，种子的外胚乳、内胚乳或子叶细胞的形状，细胞壁增厚情况及所含脂肪油、糊粉粒或淀粉粒等均是显微鉴别的重要特征[1]。显微鉴别方法被广泛应用于中药材种子的鉴定中，如白术和苍术的种子外观上非常相似，在生产、流通和销售中极易混杂，从而影响种子品质和药材质量。张杰等[15]通过外观性状鉴别和显微鉴别将白术与苍术瘦果进行了区分。通过对铁棒锤和伏毛铁棒锤的种子粉末进行显微观察，发现铁棒锤种子的外种皮细胞与伏毛铁棒锤存在差异，以此可鉴别这2种植物[16]。通过显微观察发现，川党参与素花党参种子的横切面上的种皮细胞及种胚细胞含有的晶体类型不同，表明素花党参和川党参可通过其种子的外观性状及显微特征进行鉴别[17]。黄璐琦[1]主编的《中国中药材种子原色图典》图文并茂地展现了种子的形态特征、微观特征，是从外观性状到微观特征进行全面系统研究的中药材种子图典，填补了我国中药材种子显微研究的空白。

1.3 理化分析鉴定

中药材种子理化分析鉴定法主要包括色谱法、光谱法等。一般将种子进行提取处理后，采取薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）及紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）等方法进行分析，得到能够标识其化学特征的图谱[1]。其中，近红外光谱（NIRS）技术具有分析速度快、可同时分析多种成分、不对样品造成损伤等优点，在中药鉴定领域受到了越来越广泛的关注[18-19]。赵景辉等[20]利用NIRS对不同产地、种类的人参和西洋参种子样品进行聚类分析并建立了鉴别分析模型，结果显示所建立的鉴别分析模型能有效地判别人参和西洋参的种子类别。彭惜媛[21]运用多级红外光谱宏观指纹分析法对芥子、莱菔子、黑豆、牵牛子等12 种种子进行鉴定，根据种子样本IR 中吸收峰形状、峰位置和峰强度等指纹特征对其进行逐级鉴定，逐渐发现样品之间的共性和差异，提供了系统的种子药材鉴别方法。

1.4 分子鉴定

分子鉴定一般指依据大分子（蛋白质和核酸）特征的鉴定，分为蛋白质标记技术和DNA 分子标记技术[22]。目前，已有多种相关技术引入中药材种子种苗真实性鉴定中。

1.4.1 蛋白质标记技术 包括蛋白质电泳、同工酶电泳、特异酶类的活性实验及抗体反应等[23]。最常用的蛋白质电泳鉴定法是利用中药种子中所含蛋白质分子大小、形状或所带电荷差异，通过电泳分离而鉴别种子的方法。该方法广泛应用于中药材种子真实性鉴定中[22]，常见有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和毛细管电泳（CE）[23-24]。张琼光等[25]对2 种类型厚朴种子蛋白质进行分析，结果显示，2 种类型厚朴种子蛋白质电泳图谱有明显差异，可作为鉴别依据之一。杨玉霞等[26]对大黄及其混伪品的种子蛋白电泳研究结果表明，除伪品大黄（河套大黄）未见有蛋白谱带外，正、混品大黄具有各自的鉴别谱带，且在谱带的级别、分布区域及数量上均有明显的区别。李晓琳等[27]对15 个产地的刺五加种子和2 个产地的短梗五加种子中可溶性蛋白进行电泳分析，得出不同产地的刺五加种子蛋白电泳图谱具有一定的种内差异性。该电泳方法和标准蛋白图谱可作为刺五加及短梗五加种子的鉴别依据。陆国弟等[28]通过研究发现，铁棒锤和伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱在蛋白质谱带位置和强弱上有一定差异，PAGE 技术可用于铁棒锤种子纯度检测，其蛋白质图谱可作为铁棒锤与伏毛铁棒锤种子的鉴别依据。

1.4.2 DNA 分子标记技术 DNA 分子标记技术是随着分子生物学的发展而发展起来的一种新型的鉴定方法，通过分析生物体间具有遗传信息差异的DNA 片段，进而揭示生物体内在基因的排布规律及其表型性状的表现规律，具有速度快、灵敏度高、特异性强、准确可靠等优点，且不受生物体生长发育阶段、供试部位、实验条件等因素的影响。DNA分子标记技术有限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）、单核苷多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、DNA 条形码（DNA barcoding）等[29-30]均为国内外研究热点。

1.4.2.1 RFLP 技术 RFLP 是由Botsein 等提出的应用最早的分子标记，该方法依据序列差异并产生特定的限制性内切酶酶切位点，酶切后根据酶切片段长度的变化或片段数量的增减进行鉴定[31]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版一部中收录了川贝母聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）鉴别法。由于川贝母基因组rDNA 存在限制性内切酶Sma I的单一位点（5′-CCCGGG-3′），而非川贝类的基因组在此处的序列为（5′-CTCGGG-3′），因此可以用这种方法区别川贝母和其他贝母[32-33]。王自强等[34]通过对特征片段进行PCR 扩增，可将梅花鹿及马鹿来源的骨粉样品与牛、猪、狗等动物骨粉样品进行区分，在PCR法的基础上，采用RFLP 技术，通过对限制性内切酶XbaI 进行酶切后的片段长度进行分析，可进一步区分梅花鹿与马鹿来源的骨粉样品。胡氏苘麻与苘麻种子形态较为相似，仅通过种子形态进行准确鉴别存在困难。翟会锋等[35]对胡氏苘麻和苘麻进行PCR-RFLP 分析，首次从分子水平上对这2 个物种进行了鉴定区分。朱晓燕等[36]利用核糖体内部转录间隔区2（ITS2）序列上可被限制性内切酶HpyCH4Ⅲ识别的关键差异位点，建立2种不同性状白茅根的PCR-RFLP鉴别方法。

1.4.2.2 SSR 技术 SSR 是近年来发展起来的建立在PCR 基础上的第二代分子标记。由于不同物种的SSR 序列及重复次数不同，使SSR 标记在不同物种表现出高度的保守性和重复性，从而可以对不同物种进行准确鉴定[37-38]。SSR 标记技术因具有多态性高和共显性等优点，在中药材种质鉴定中也有应用。陈子易等[39]利用SSR 标记技术对人参和西洋参进行了种质资源的鉴别，该方法可实现人参和西洋参的种间鉴定。李春花等[40]利用SSR 标记技术构建云南苦荞种质资源分子身份证，为云南苦荞的种质资源鉴定和保护提供依据。

1.4.2.3 DNA 条形码 DNA 条形码技术利用一段标准的DNA 序列从基因层面对物种进行鉴定，不受环境等外部因素影响，具有通用、快速、准确等特点，逐渐成为中药材种子鉴定的研究热点[41]。羌活与宽叶羌活种子形态特征相似，难以明显区分，张改霞等[42]基于ITS2 条形码对27 份药用植物羌活种子样品进行分子鉴定，结果表明，27 份种子样品中有24 份样品为《中国药典》2010 年版规定的羌活正品基原种子，包括13 份羌活种子、11 份宽叶羌活种子，另外3 份样品不属于羌活基原植物种子。方海兰等[43]收集了19 份重楼种子、7 份重楼种苗，以ITS为条形码进行基原物种鉴定，结果表明，有20 份样品为非《中国药典》2015 年版基原物种，甚至有重楼属以外的种属。刘金欣等[44]通过构建黄芩ITS2 条形码数据库，建立黄芩种子DNA 条形码鉴定新方法，保障黄芩种子基原准确。戚文涛等[3]采用传统形态鉴定方法结合DNA 条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。基于ITS2 条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子，41 份柴胡属种子样品中有30 份柴胡、3 份狭叶柴胡、5 份三岛柴胡、2 份藏柴胡及1 份小叶黑柴胡。将DNA 条形码技术扩展到中药材种子种苗鉴定领域，对推动中药材种子种苗标准化具有重要意义。

1.4.2.4 SNP 技术 1996 年，美国学者Eric S.Lander 正式提出了第三代分子标记技术——SNP[45]。SNP 技术本质是DNA 单碱基变异，通过检测分析染色体上某个位置单个核苷酸的差异，可以实现区分不同个体遗传物质的差异，从而辨别不同的物种。与其他传统分子标记相对比，SNP 分子标记技术分布较广泛、遗传较稳定、易于基因型分型鉴定，特别是对于种间的快速鉴定。近年来，SNP 分子标记技术在中药材种子种苗真实性鉴定中被广泛研究和应用[29]。Chen 等[46]采用ITS2 序列对人参属药用植物的SNP 位点进行研究，发现5 个稳定的可作为独特标记用来区分人参属不同物种以及人参、西洋参混合粉末的种间变异位点，首次借助SNP 位点成功鉴定人参、西洋参混合粉末。王丽丽等[47]基于SNP 位点对藏菖蒲及其近缘种进行鉴定，通过对藏菖蒲同属近缘种的96 条ITS2 序列进行分析，发现第23 位和212位存在稳定的SNP位点，可准确鉴定藏菖蒲。

2 讨论与展望

中药材种子种苗是保证中药材质量的源头，优质的种子种苗是实现中药材规范化生产的基础和首要条件。当前，中药材种子种苗交易以个体农户交易为主，没有固定的经营主体，门店交易大部分无经营许可证，种子无包装。区分种子真伪优劣主要是凭经验，种源混杂，近缘种、混伪品充当正品，质量无法保障。

性状鉴定、显微鉴定、理化分析鉴定和分子鉴定作为常用的中药材种子种苗真实性鉴定方法，各有特点，在针对具体品种制定鉴定方法时应根据实际情况进行选择。性状鉴定是目前中药材种子种苗生产、交易过程中使用最多的鉴定方法，方法简单、易操作、节约时间，但对鉴定者经验水平要求较高。微性状鉴定是目前中药材种子鉴定的发展趋势。该方法既可以弥补经验方面误差与不足又能够快速鉴别种子类中药材，非常适用于基层中药快检工作。显微鉴定主要是通过种子横切面的不同组织构造的比较作为鉴别特征来辨别，不受外观形态影响。中药材种子理化分析鉴别方法对实验设备的配置、操作技术及实验条件均有较高要求，且只针对含特定成分的中药材种子，具有一定局限性。DNA 分子标记技术是近年发展起来的一种新型的鉴定方法，具有简便、快速、准确的特点。但无论在广度还是深度上，当前研究所涉及的分子标记类型仍有不足，其更为广阔的应用前景还有赖于DNA 分子标记技术的进一步发展。

与中药材种子种苗鉴定现状相比，我国农作物种子检验质量标准体系已基本形成并建立了健全的种子质量监督抽查制度，拥有种子质量检验队伍和网络[48]，采用大田形态鉴定法、生化标记鉴定法和DNA 分子标记鉴定法可以实现农作物种子的真伪鉴别[23]。中药材种子种苗质量控制体系建设工作还有待进一步完善[49]，可参考农作物种子鉴定相关的技术方法，制定实施系统全面的质量标准和检测技术，促进中药材产业健康发展。

中药材种子种苗真实性鉴定技术要取得进一步发展，笔者认为可从以下几个方面开展深入研究：首先，加强中药材种子鉴定与分类系统基础研究。目前，药学界对中药材种子种苗的鉴定研究缺乏足够的重视，尚未建立完善的、综合各种种子特征的鉴定与分类体系[50]，导致对种子的鉴定困难重重。因此，开展种子鉴定与分类系统的课题研究是中药材种子种苗真实性鉴定的基础。其次，借助基因组学和生物信息学等先进技术，扩展DNA 分子标记技术在中药材种子种苗近缘种及不同产地种子鉴别中的研究和应用。最后，提高种子质量意识，规范中药材种子种苗交易市场。中药材种子交易以个体农户交易为主，种子质量意识淡薄，真实性鉴定多通过主观进行判断，造成种子质量事故时有发生。因此，应规范中药材种子种苗生产与经营、建立出厂放行制度、采用现代分析技术在中药材种子种苗质量标准中对种子真实性鉴定提出明确要求并在生产实践中推广应用。