藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

许明，林世强，倪冬昕，伊恒杰，刘江洪，杨志坚，郑金贵

藤茶查尔酮合成酶基因的克隆及功能鉴定

许明，林世强，倪冬昕，伊恒杰，刘江洪，杨志坚，郑金贵

（福建农林大学农学院/作物生物技术福建省高校重点实验室/作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州 350002）

【】查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶，从藤茶中克隆，分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性，通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定，为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。根据藤茶转录组测序结果设计引物，以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板，PCR扩增得到。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征，使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对，并构建系统进化树。通过原核表达系统获得的重组蛋白，分析该重组蛋白对底物的催化活性，并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对在藤茶不同器官的表达水平进行分析，并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体，通过叶盘法转化烟草，筛选阳性转基因后代，对T2代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。的ORF长1 182 bp，编码393个氨基酸，基因组序列长1 315 bp，含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明，AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现，AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基，包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点，与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示，AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支，亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，在成熟叶和花中的表达量最高，在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示，重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素，说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系，其中2株的花瓣颜色明显加深；与对照相比，转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%，OE3的黄酮醇含量没有显著差异，OE4的黄酮醇含量提高39.1%。AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶，过量表达可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。

藤茶；查尔酮合成酶；酶活性；花青素；黄酮醇

0 引言

【研究意义】藤茶学名为显齿蛇葡萄（W.T.Wan），属于葡萄科蛇葡萄属藤本植物，主要分布在中国福建、云南、广东、广西、贵州和湖南等长江以南的山区，民间将其作为茶药两用植物应用已有数百年的历史[1]。藤茶的主要有效成分是以二氢杨梅素为主的黄酮类化合物，具有抗氧化、保肝护肝、降血压和抗肿瘤等多种功效[1-3]。研究表明，品种、季节和栽培条件等多种因素都会造成藤茶黄酮含量出现较大差异，从而影响藤茶产品的质量甚至疗效[3-5]。因此，开展藤茶黄酮类化合物合成关键基因的克隆、功能鉴定及其调控机制研究，对藤茶药用品质提升及其资源持续高效利用具有重要意义。【前人研究进展】黄酮类化合物（又称类黄酮）的生物合成途径在国内外已有了较为广泛地研究，其合成途径的主要步骤已基本探明[6]。查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）属于III型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）家族，是类黄酮合成途径中的第1个关键结构酶，负责催化3分子丙二酰CoA与1分子的对-香豆酰辅酶A缩合形成柚皮素查尔酮，并进一步生成黄酮醇、异黄酮和花青素等各类黄酮类化合物[7]。广泛存在于高等植物中，目前已经在烟草[8]、虎杖[9]、苹果[10]、桑树[11]、雪莲[12]、地钱[13]、香雪兰[14]等多种植物中被克隆，并明确了其功能。主要以多基因家族形式存在[15]，不同植物中数目不等，例如在水稻中可能有27个[16]，烟草中至少有5个成员[8]，而金鱼草中只有1个[17]。近期Li等[18]利用高通量转录组测序技术，注释了多条与藤茶相关的unigene，暗示在藤茶中也是以多基因家族形式存在。对不同植物的分子系统进化研究发现，超基因家族的起源较早，但在长期进化过程中，家族成员内部发生了多样的遗传改变，使其功能上可能各有分工[7]。典型的CHS催化生成查尔酮，进入花青素合成途径，而其他成员则催化生成一些与植物抗逆相关的产物[15]。增强或抑制不同植物的表达，能改变植物花色或抗逆能力[14,19-20]。此外，的表达受发育阶段和环境因子的影响，在不同组织和器官中的表达模式也存在差异[21-22]。【本研究切入点】前期研究已从藤茶中克隆和注释了一部分，并对其序列进行了生物信息学分析[18,23]，但对其功能的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究基于转录组测序基础，从藤茶中克隆得到1条的编码区序列，命名为，通过生物信息学分析、组织表达特异性分析、体外酶活性检测和烟草遗传转化试验，探讨该基因在藤茶类黄酮生物合成过程中的作用，为进一步研究藤茶类黄酮高效累积的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

试验于2017年9月至2020年5月在福建农林大学农学院作物生物技术福建省高校重点实验室进行。

1.1 植物材料与试剂

藤茶引自福建尤溪县下村林场，经福建农林大学植物学教研室鉴定为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄。在同一植株上分别采集幼叶、成熟叶、老叶、茎、花和根，液氮速冻后研磨成粉末，然后分成2份，一部分用于总RNA提取，另一部分冻干后贮存于-80℃冰箱，用于总黄酮的提取与含量测定。

植物总RNA提取试剂盒、质粒提取DNA和胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、克隆载体pMD-18T、原核表达载体pET28a-pGTf2、大肠杆菌感受态细胞（DH5α）、ExTaq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。反转录试剂盒和Sybr Green qPCR Master Mix购自BBI生命科学有限公司。二氢杨梅素、槲皮素对照品购自上海同田生物技术股份有限公司，丙二酰辅酶A、柚皮素购自美国Sigma公司，对-香豆酰辅酶A购自德国MicroCombiChem公司。引物合成和测序均由上海生工有限公司合成。

1.2 基因组DNA、总RNA的提取和第一链cDNA合成

采用CTAB法提取藤茶叶片基因组DNA。藤茶不同组织RNA的提取参照笔者实验室前期建立的方法[24]进行，烟草总RNA的提取参考植物RNA提取试剂盒说明书进行。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA和总RNA的完整性，用Nanodrop 2000分光光度计测定样品浓度和纯度。利用PrimeScript™ RT reagent试剂盒（Takara）将总RNA反转录为第一链cDNA。

1.3 AgCHS1的克隆与序列分析

根据前期藤茶叶片转录组的测序结果（NCBI登录号：SRP241021），设计5′端分别带H I和I酶切位点的特异性引物AgCHS1-F/R（表1），分别以藤茶叶片DNA和cDNA为模板，利用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 S，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，将回收产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆进行测序。

表1 本试验中所用的引物序列

将测序所得序列在NCBI上进行同源性比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），借助ProtParam（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析编码蛋白质的氨基酸组成、等电点和相对分子质量。使用CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析其保守结构域。采用DNAMAN软件进行氨基酸的多重比对分析。使用MEGA 6软件构建不同物种CHS蛋白的系统进化树。

1.4 AgCHS1重组蛋白原核表达及纯化

用HⅠ和Ⅰ双酶切含有的pMD-18T载体，回收片段，连接到用相同内切酶消化的pET28a-pGTf2载体上，将连接产物导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，鉴定出阳性单菌落并测序。确定序列及载体组装无误后，使用0.4 mmol∙L-1IPTG诱导表达目的蛋白，诱导表达条件及步骤参照LIN等[25]的方法。采用Bradford法测定蛋白浓度。

1.5 AgCHS1体外酶活性试验

AgCHS1酶活性测定参照YAHYAA等[10]的方法并略作修改，250 µL反应体系包括15 µmol·L-1的对-香豆酰辅酶A、56 µmol·L-1的丙二酰辅酶A、0.1 mol·L-1磷酸钾缓冲液（pH 7.0）以及2.0 µg纯化的AgCHS1。将上述反应体系置于35℃下反应30 min后，加入等体积乙酸乙酯抽提2次，于12 000 r/min离心10 min；取上清液真空干燥后，加入250 µL 50%（v/v）的甲醇水溶液溶解残留。通过UPLC（Waters，2695）对酶促反应产物进行初步分析，再利用HPLC-MS（Thermo Fisher，LCQ Fleet）对产物进行鉴定。液相条件：液相柱BEH C18，粒径1.7 μm, 2.1 mm×100 mm；柱温35℃；进样量2 μL。A相：1.0%乙酸；B相：100%乙腈；流速：0.3 mL∙min-1。质谱条件：离子源为电喷雾（ESI-），毛细管温度300℃，鞘气（N2）15 arb，喷雾电压-4.47 kV，检测电压1.5 kV，时间100 ms，碰撞气体He，母离子选择宽度：3 u，采集范围100—600 m/z。

1.6 基因表达分析

根据所获得的序列，采用Primer5.0软件设计荧光定量PCR引物（表1）。藤茶的内参基因为[26]，烟草的内参基因为。荧光定量反应体系为：SybrGreen qPCR Master Mix（2×）10 μL，10 μmol·L–1上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O至终体积20 μL。反应在ABI StepOne型荧光定量PCR仪上进行，程序为95℃变性3 min，95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，45个循环，于60℃收集荧光，反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线，每个反应重复3次，采用2−ΔΔCt算法计算基因相对表达量。

1.7 植物表达载体构建及转基因烟草的获得

利用H Ⅰ和I双酶切pBI121载体，回收载体大片段，与1.3中回收的片段连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，通过酶切鉴定阳性克隆，得到植物表达载体pBI-35S:AgCHS1，采用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105中，按照Ning等[27]的方法进行烟草遗传转化。提取T0代抗性植株叶片DNA，用引物AgCHS1-P1/P2进行PCR验证，阳性植株连续自交种植2代后获得T2代植株，用于后续的检测。

1.8 黄酮类物质的提取与测定

藤茶不同器官总黄酮的提取参照Li等[18]介绍的提取方法，然后采用硝酸铝比色法[28]，检测样品溶液在324 nm波长的吸收值，通过二氢杨梅素的标准曲线换算样品中的总黄酮含量。烟草花瓣花青素的提取与测定按照Wang等[29]的方法，并略作修改。取50 mg野生型和转基因烟草的花瓣（鲜重，M），加入1 mL酸化甲醇（含1% HCl（v/v）），黑暗条件下提取24 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用紫外可见光分光光度计（Thermo Scientific，Evolution 201）测定530 nm与657 nm处的吸光值（A530和A657）。相对花青素含量（Q）用公式（Q=（A530-0.25×A 657）M）计算。烟草花瓣黄酮醇的提取与测定参照TIRUMALAI等[30]的方法进行，并略作修改。取100 mg新鲜的烟草花瓣在液氮中研磨成粉末，加入2.0 mL 75%乙醇提取3 h，滤液干燥后，溶解于1.0 mL 75%乙醇中。取0.1 mL提取液，加入0.5 mL 5% NaNO2，摇匀放置6 min，再加10% Al（NO3）3，摇匀放置6 min，最后加入2.5 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液中止反应，放置15 min后，在波长510 nm处测定吸光值。按照槲皮素的标准曲线换算样品中总黄酮醇含量。

2 结果

2.1 AgCHS1的克隆和生物信息学分析

根据转录组测序信息，设计特异性引物，以藤茶叶片cDNA为模板，扩增得到的ORF序列（GenBank登录号为MT316507）长度为1 182 bp，编码393个氨基酸。以基因组DNA为模板，扩增得到的gDNA序列（GenBank登录号为MT316508）长度为1 315 bp（图1-A），与ORF序列比对后发现，具有一个内含子（133 bp），外显子1为178 bp，外显子2为1 004 bp，内含子遵循GT/AG规则（图1-B）。

通过ProtParam在线分析AgCHS1蛋白理化性质，其理论分子量为42.8 kD，理论等电点（pI）为6.15，分子式为C1908H3059N513O565S19，带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）为48个，带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）为43个，不稳定系数为34.71，属于稳定性蛋白。平均亲水性（GRAVY）为-0.045<0，表明AgCHS1属于亲水性蛋白。

A：AgCHS1的PCR扩增产物，M：DL5000；1：ORF扩增产物；2：基因组DNA扩增产物。B：AgCHS1的结构

利用DNAMAN软件将AgCHS1与葡萄、水稻、拟南芥、烟草等常见植物的CHS进行序列多重比对，发现该蛋白与葡萄CHS的氨基酸序列相似度最高，达到96.7%，与陆地棉、水稻、拟南芥、烟草的相似度分别为89.1%、82.2%、84.5%和86.5%，与付明等[23]报道的藤茶CHS氨基酸序列存在较大差异，二者相似度为88.1%。AgCHS1含有查尔酮合成酶家族典型的Cys-His-Asn三联活性中心位点和2个高度保守的苯丙氨酸残基Phe215和Phe265（图2），这些位点与查尔酮合成酶底物特异性相关[29]。此外，AgCHS1还具有丙二酰辅酶A结合位点和2个高度保守的CHS特征序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL（图2）。进一步说明本研究所克隆的序列为藤茶的序列。

采用MEGA 6软件邻接法（Neighbor-Joining，NJ），对包括藤茶在内的14种植物的CHS蛋白序列进行聚类分析，构建系统进化树。结果显示，藤茶AgCHS1与同科的葡萄、山葡萄进化关系最近，与圆叶葡萄、茶树、陆地棉的进化关系也较近，而与白鲜、甜橙等进化关系较远（图3）。

2.2 藤茶不同器官AgCHS1的表达及总黄酮含量

对在藤茶幼叶、成熟叶、老叶、茎、花和根中的表达进行分析。结果显示，在藤茶所有器官中均有表达。其中，成熟叶和花中的表达量最高，在老叶中的表达量最低。在叶片3个不同发育时期，的表达水平呈先升后降的趋势。总黄酮含量变化趋势与的表达变化基本一致（图4），二者在0.05水平上呈显著正相关（相关系数为0.9224），说明的表达在藤茶总黄酮积累过程中可能发挥着重要作用。

2.3 AgCHS1的原核表达、纯化与酶活性测定

将重组质粒pET28a-AgCHS1/pGTf2转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，超声裂解和Ni亲和层析柱纯化，得到纯化的AgCHS1重组蛋白。经SDS-PAGE确定其分子量约为43 kD（包括His标签），与预期分子量大小一致（图5）。通过Bradford法测定AgCHS1蛋白含量为0.75 mg∙mL-1。

在体外酶促反应中，当以对-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A为底物时，AgCHS1能有效催化柚皮素查尔酮合成，然后柚皮素查尔酮自发异构化为柚皮素。HPLC-MS结果显示，AgCHS1酶促反应产物色谱峰的保留时间出现在6.8 min，与柚皮素标准品的保留时间一致（图6-A、B），而空载蛋白对照组未观察到目标峰（图6-C）。柚皮素标准品二级质谱中母离子峰的质荷比（m/z）为271，其子离子峰m/z为151和177（图6-D、E），通过文献检索和标准品比对，确定酶促反应产物二级质谱中具有相应的特征离子峰（图6-F、G）。说明AgCHS1编码的蛋白具有查尔酮合成酶活性，在体外能够催化对-香豆酰辅酶A生成柚皮素。

2.4 AgCHS1在烟草中的过量表达

构建由组成型启动子CaMV35S调控表达的植物表达载体，采用农杆菌介导法将其转到早花烟草中，获得5株独立的卡那霉素抗性植株。经PCR检测5株全部呈阳性（图7-A），其中2株（OE3和OE4）的花瓣颜色比野生型对照明显加深（图7-B），且该表型在后代能稳定传递。花青素含量测定结果显示，过表达株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别比野生型对照提高56.6%和25.3%（图7-C，<0.05）。进一步通过荧光定量PCR检测发现，在株系OE3和OE4花瓣中的转录水平要远高于野生型株系（图7-D），且其表达量与花青素含量相一致，说明的过量表达促进了烟草花瓣的花青素生物合成。另外，CHS同时也是植物黄酮醇合成途径上游编码酶基因，其上调表达可能影响黄酮醇的累积，因此对转基因烟草花瓣的黄酮含量进行测定（图7-E）。结果显示，在上述两个过表达株系中，虽然OE3的花瓣颜色比对照加深更明显，但其黄酮醇含量与野生型对照没有显著差异，而株系OE4却比对照提高了39.1%（<0.05）。

AgCHS1：藤茶Ampelopsis grossedentata；VvCHS：葡萄Vitis vinifera NP_001267879.1；GhCHS1：陆地棉Gossypium hirsutum CV72638；OsCHS：水稻Oryza sativa CAA61955.1；AtCHS：拟南芥Arabidopsis thaliana AAA32771.1；NtCHS：烟草Nicotiana tabacum ANA78328.1。▲：Cys-His-Asn三联活性中心；★：表示苯丙氨酸残基Phe215和Phe265；方框为CHS高度保守特征序列，下划线为丙二酰CoA结合位点▲: Cys-His-Asn triple active center; ★: phenylalanine residues Phe215 and Phe265; the highly conserved CHS signature sequence are boxed with black line; the malonyl-CoA binding site are underlined

图3 AgCHS1与其他植物CHS蛋白的系统进化树分析

不同字母表示在P<0.05水平差异显著。下同Different letters indicate statistical difference (P<0.05). The same as below

M：蛋白Marker；1：离心后的裂解液上清；2：裂解液上清经过Ni柱的流穿；3：Binding buffer洗脱；4：Binding buffer + 60 mmol∙L-1咪唑洗脱；5：Binding buffer + 90 mmol∙L-1咪唑洗脱；5：Binding buffer + 250 mmol∙L-1咪唑洗脱

3 讨论

CHS是高等植物中分布最广泛的类型III PKS，具有相对保守的基因结构和较高的序列相似性[31-32]。本研究根据藤茶叶片转录组测序结果设计引物，克隆获得，与多数物种的大小基本一致[8-14]。目前报道的多数植物序列只含有1个内含子，但也有少数例外，比如金鱼草含有2个内含子[17]，紫丁香没有内含子[29]，而在小立碗藓（Physcomitrella patens）基因家族的14个成员中，存在外显子-内含子的多种组合类型[33]。本研究克隆的藤茶基只含有1个内含子，这与多数报道[8,13-14,32]的植物结构相类似。序列多重比对发现，AgCHS1包含查尔酮合成酶家族的特征序列以及高度保守的活性氨基酸残基，与葡萄、水稻、拟南芥、烟草等常见植物的CHS氨基酸序列有较高的相似性（82.2%—96.7%），证实属于结构保守型CHS基因。另外，AgCHS1与付明等[23]报道的藤茶CHS上存在一定的序列差异，但它们的特征性保守位点基本相同（结果未列），据此判断它们属于藤茶CHS家族的不同成员，可能在藤茶类黄酮生物合成过程中发挥相似的作用。以上这些结果说明在序列上与其他植物的有诸多相似之处，属于典型的查尔酮合成酶家族基因。

CHS的体外酶活性于1972年首次在欧芹悬浮细胞培养物中被检测到[34]。本研究通过原核表达重组蛋白的方法，对AgCHS1重组蛋白的体外酶活特性进行了分析，发现该重组蛋白可以催化对-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A的缩合反应，形成柚皮素，说明AgCHS1具有查尔酮合成酶的活性。值得注意的是，酶促产物除了主产物柚皮素之外，还存在少量的副产物（图6-A），类似的情况也出现在小立碗藓[35]、地钱[36]等植物CHS的体外酶促反应中，推测该副产物可能是CHS酶促反应早期的脱轨产物Bisnoryangonin（BNY）或4-Coumaroyltriaceticacid lactone（CTAL）[37]，有待于进一步鉴定。另据报道，CHS起始底物较为宽泛，但对脂肪族酰基辅酶A和芳香族酰基辅酶A具有明显偏好性[14,38]。例如，对小立碗藓PpCHS的体外活性分析表明，该酶的底物除了对-香豆酰辅酶A外，还可以是肉桂酰辅酶A或二氢香豆酰辅酶A，但在这些底物中，PpCHS更偏好对-香豆酰辅酶A[35]。同样，黄芩CHS的底物特异性分析也表明，CHS可以同时接受苯甲酰辅酶A、苯乙酰辅酶A、异戊基辅酶A和异丁酰辅酶A等芳香族和脂肪族酰基辅酶A，生成多种反应产物[38]。鉴于上述这些发现，需要进一步研究对不同底物的催化效率，以明确其体内的生理作用底物。

A：转基因烟草的PCR鉴定；B：花瓣表型；C：花瓣表达量；D：花瓣相对花青素含量；E：花瓣的相对黄酮醇含量

M：DL1000 DNA标准分子量；P：质粒对照，WT：野生型；OE1—OE5：转基因株系。不同字母表示在<0.05水平差异显著

A: PCR identification of transgenic tobacco; B: Petal phenotypes; C:expression in petal; D: Relative anthocyanin content; E: Relative flavonol content; M: DNA marker DL1000; P: Plasmid control; WT: Wild type; OE1-5: different transgenic lines. Different letters indicate statistical difference (<0.05)

图7 过量表达对烟草花色、花青素和黄酮醇含量的影响

Fig. 7 Efects of overexpressionon the color, anthocyanin and flavonol content of tobacco

黄酮类物质与植物花色关系密切[39]，作为类黄酮合成途径的上游编码酶基因，其基因表达量的增加或减少都可能导致植物花色的变化。在矮牵牛中过量表达小苍兰，可显著增加黄酮醇和花青苷的含量，并使花瓣由原来的白色变为粉红色[14]。在烟草中过量表达紫丁香，可使花瓣颜色明显加深，花青素含量提高50%以上[29]。相反地，抑制烟草[19]、大丽花[40-41]和三环草[42]等植物中的表达，可导致花青素含量降低，花色随之变淡或出现完全白色的花。本研究将转入野生型烟草中过表达，结果显示转基因植株花瓣颜色由淡紫色变成紫红色，花青素含量也相应的增加，此结果与前人报道的结果基本一致。值得注意的是，在本研究获得的2个烟草过表达转基因株系中，株系OE3花青素含量的增加幅度大于株系OE4，但其黄酮醇含量却没有增加，而株系OE4却提高了39.1%，这可能与黄酮醇和花青素合成调控方式较为复杂有关。黄酮醇和花青素处于类黄酮合成途径不同的代谢分支，它们的合成除了受上游CHS、F3H等酶的影响，还与下游DFR和FLS两种酶对分支点中间产物二氢黄酮醇的竞争有关[43]。

4 结论

从藤茶克隆到查尔酮合成酶基因，该基因编码蛋白具有典型的CHS家族蛋白保守结构域，在体外能够催化对-香豆酰辅酶A生成柚皮素，过量表达该基因可以提高烟草的花青素和黄酮醇的含量，说明可能在藤茶类黄酮的生物合成中发挥重要作用。

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Cloning and Function Characterization of Chalcone Synthase Gene

XU Ming, LIN ShiQiang, NI DongXin, YI HenJie, LIU JiangHong, YANG ZhiJian, ZHENG JinGui

(College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Crop Biotechnology in Fujian Province University/Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fuzhou 350002)

【】Chalcone synthase(CHS) is the first key enzyme in the biosynthesis of plant flavonoids. In this study, thewascloned from, the gene sequence and tissue specific expression were analyzed, and the gene function was characterized viaenzymatic activity assay and transformation of, aiming to provide a theoretical basis for further elucidating the flavonoid accumulation of the. 【】The primers were designed according to the transcriptome ofand the leaf cDNA and genomic DNA were used as templates to amplify thewith PCR. The sequence features were analyzed with bioinformatic methods. The MEGA6 and DNAMAN were used for multiple sequences alignment and phylogenetic tree construction. The AgCHS1 recombinant protein was obtained via prokaryotic expression, and the enzymatic activities of the protein on substrates were assayed by identifying the catalytic products with HPLC-MS. The expression ofAgCHS1 in different organs was quantified by qRT-PCR, and the content of total flavonoids was determined by Al(NO)colorimetric method. The overexpression vector was constructed and transformed to N. tabacumby using the leaf disk method. The transgenic plants were screened and the contents of anthocyanin and flavonol in the petal of T2strain were measured.【】The ORF ofhad a length of 1 182 bp and encoded 393 amino acids. The genomic DNA spanned 1 315 bp, containing 2 exons and 1 intron. The bioinformatic analysis showed that AgCHS1 was a stable hydrophilic protein. The results of sequence alignments indicated that the AgCHS1 possessed the signature sequence and enzymatic site residues of the chalcone synthase gene superfamily, including the binding site of malonyl-CoA and triple active center, which share a high similarity with the CHS proteins of other species. The phylogenetic analysis showed that AgCHS1 had a close relationship with and was in the same clade with the CHSs ofand. The results of fluorescent qPCR showed thatexpressed highest in the mature leaf and the flower, and lowest in the old leaf. There was a positive correlation between the expression level ofgene and the content of total flavonoids in different organs of. Theenzymatic analysis showed that the recombinant AgCHS1 was able to catalyze the substrates-coumaroyl-CoA and CoA malonyl-CoA to produce naringenin, demonstrating the activity of chalcone synthase. 5 transgeniclines were obtained, 2 of which showed a significant deeper leaf color. The anthocyanin contented of the transgenic lines OE3 and OE4 increased by 56.6% and 25.3%, respectively, compared to the control. The flavonol content of line OE3 showed no significant difference, which of the line OE4 were increased by 39.1%.【】The AgCHS1 was the key enzyme in the flavonoid biosynthesis of, and the overexpression ofincreased the contents of anthocyanin and flavonol in transgenic plants.

; chalcone synthetase; enzyme activity; anthocyanin; flavonol

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.012

2020-05-14；

2020-07-15

国家科技支撑计划（2013BAD01B05）、福建农林大学科技创新专项基金（KFA17424A）

许明，Tel：0591-83789231；E-mail：xmfau@163.com。通信作者郑金贵，Tel：0591-83789231；E-mail：jgzheng@fafu.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）