哇巴因的抗肿瘤作用及其机制的研究进展

彭连杰 孙 畅 胡 晶 刘家辉

1.重庆医科大学口腔医学院，重庆 400016； 2.重庆医科大学第一临床学院，重庆 400016；3.重庆医科大学检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016

恶性肿瘤治愈率低，死亡率高，严重危害人类生命健康。寻求恶性肿瘤的特效治疗方法以提高患者生存率和治愈率已成为医学界人士的首要目标之一。哇巴因（Ouabain）主要来源于夹竹桃科植物苦毒毛旋花，可抑制细胞膜上Na+/K+-ATP酶，使细胞内Ca2+浓度增加，心肌收缩力增强，故临床上常用于心力衰竭等疾病[1]。1967年Shiratori[2]首次证实哇巴因可在体外抑制恶性肿瘤细胞增殖后，哇巴因在抗肿瘤方面的作用逐渐受到重视。愈来愈多的研究表明，哇巴因对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用，且对部分类型肿瘤细胞表现出较好的选择性。但具体机制尚未完全明确。针对哇巴因抗肿瘤作用及其相关机制的研究有望解决传统肿瘤治疗方法所面临的治愈率低、耐药性高等问题，为肿瘤治疗提供新思路。本研究将对哇巴因用于肿瘤治疗及其机制研究的新进展做一综述，以期能对后续研究者有所启发。

1 哇巴因在肿瘤治疗中的作用及其机制

1.1 抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡

近年来，许多研究表明，哇巴因对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用并能诱导部分肿瘤细胞发生凋亡，包括食管肿瘤细胞、乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞、淋巴瘤细胞、大肠癌细胞、肺癌细胞等，其相关机制非常复杂，至今尚未完全阐明。如Meng等[3]使用不同浓度哇巴因处理人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞，发现随着哇巴因浓度增大，出现Raji细胞的增殖抑制率显著增大、cleaved-caspase-3和caspase-3水平升高、Bax活性升高和抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低且自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表达上调等变化，这表明了哇巴因对Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的增殖具有抑制作用，并能诱导其发生凋亡和自噬，且其作用效果表现出浓度依赖性。哇巴因抑制肿瘤细胞增殖可能与Sox基因家族有关。程中华等[4]发现人食管OE19肿瘤细胞经哇巴因处理后生长减缓、细胞死亡增加、Sox4 mRNA和Sox4蛋白相对表达量显著降低、Sox4基因表达也显著减弱，提示哇巴因可下调Sox4基因的表达从而调控肿瘤细胞的细胞周期，抑制其增殖。Lin等[5]的研究显示哇巴因还可通过下调p38 MAP激酶6（MKK6）抑制人食管腺癌EAC细胞系（OE33和OE19）的增殖，进一步分析表明，这与MKK6受到抑制而导致Sox9转录因子水平降低有关。除Sox基因家族外，Akt/mTOR信号通路可能也参与了哇巴因抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的过程。有报道称哇巴因对人神经胶质瘤U251细胞具有增殖抑制和凋亡诱导作用，并提出这一作用可能与其下调HIF-1α、Akt、m TOR、p-mTOR的表达及上调Nrf2、p-Akt的表达有关[6]。此外，杨小飒等[7-9]也发现哇巴因可通过调节细胞内Akt / mTOR信号通路并抑制神经胶质瘤细胞中HIF-1α的表达从而剂量依赖性地抑制人脑胶质瘤U-87MG细胞的生长，减弱细胞的移动性并导致其凋亡。哇巴因的这一作用还涉及对Wnt/β-catenin通路的调控，研究发现哇巴因可以选择性杀伤大肠癌细胞HCT116和肺癌细胞A549，并能诱导其凋亡，并证明这种效果可能与哇巴因作用于LRP6和β-catenin分子抑制Wnt/β-catenin通路有关[10]。此外，哇巴因可能还通过影响肿瘤细胞的能量代谢而抑制其增殖。有研究者发现，哇巴因可通过AMPK信号通路抑制细胞内线粒体的氧化作用，促使其进行糖酵解从而减少ATP的产生，抑制乳腺癌MCF7细胞增殖[11]。哇巴因介导的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用对部分肿瘤细胞表现出选择性，其作用途径因肿瘤细胞种类不同而有差异，确切机制仍有待进一步探究。

1.2 激活细胞自噬

自噬是指真核细胞通过溶酶体降解自身胞质内的蛋白质和细胞器的过程，属于程序性细胞死亡机制的一种，其与肿瘤发生发展及治疗之间的关系十分密切[12]。最近有研究表示哇巴因可诱导肿瘤细胞自噬而死亡[13-14]。哇巴因可使肿瘤细胞内自噬相关蛋白表达增多，通过激活细胞自噬而死亡。Trenti等[13]的研究表明哇巴因可通过激活JNK（c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）而引起Bcl-2减少，破坏Bcl-2与Beclin 1间的抑制性相互作用，从而促进肿瘤细胞发生自噬性死亡[13]。此外，Rupaimoole等的研究也证明哇巴因可增强肺癌细胞对MicroRNA-34（miR-34）治疗的敏感性，哇巴因与MicroRNA-34协同作用可增强细胞自噬而杀死肺癌细胞和miR-34a缺失的类似癌症的癌细胞[14]。

1.3 哇巴因与Na+/K+-ATP酶

Na+/K+-ATP酶最主要的配体是包括哇巴因在内的强心甾类固醇（cardiotonic steroids，CTS），与CTS结合后，可触发多种细胞信号通路，导致细胞增殖、分化或促进自噬或凋亡[15]。这些效应通常取决于细胞类型以及CTS的类型和浓度。

在肿瘤发生的早期Na+/K+-ATP酶α1-亚型高表达，在晚期低表达，从而促进α3-亚型表达的增强，这提示Na+/K+-ATP酶不仅可以作为生物标志物，而且可能作为肿瘤的治疗靶点[16]。糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（GPNMB）在多种肿瘤中均有过表达，Ono等在小鼠胶质瘤模型和胶质母细胞瘤患者的肿瘤中发现这种蛋白和Na+/K+-ATP酶α亚基存在相互作用，Na+/K+-ATP酶抑制剂哇巴因可抑制高表达GPNMB转基因小鼠注射胶质瘤细胞诱导的胶质瘤生长，并阻断GPNMB诱导的胶质瘤细胞迁移[17]。Cetinkaya等通过检测接受放化疗前后的非小细胞肺癌和多形性胶质母细胞瘤患者与健康对照的Na+/K+-ATP酶活性差异发现，放化疗完成前，患者组Na+/K+-ATP酶酶活性较对照组明显升高，放化疗结束后Na+/K+-ATP酶活性较放化疗前明显降低，但仍高于健康对照组，这提示靶向该酶可能是对抗非小细胞肺癌和多形性胶质母细胞瘤的一种新手段[18]。有研究发现与非致瘤性乳腺细胞系相比，Na+/K+-ATP酶在乳腺癌中的基线表达和活性均增强，用哇巴因处理后其活性被抑制，从而显著降低了乳腺癌细胞的增殖、运动、侵袭[19]。另外，低浓度的哇巴因在不影响Na+/K+-ATP酶活性的情况下仍可阻止癌细胞生长。除了由于激活下游信号通路级联反应外，最新研究指出其可能机制是心苷类物质与Na+/K+-ATP酶相互作用，刺激活性氧的产生，并明显激活膜微区内的体积调节性阴离子通道（volume regulated anion channel，VRAC），从而产生抗增殖作用[20-21]。

1.4 化疗耐药性逆转

化疗目前作为一种治疗肿瘤的有效手段在临床上被广泛应用，但肿瘤细胞对常用化疗药品的耐药性逐渐成为肿瘤治疗无效或疾病复发的主要原因。有研究表明，哇巴因可以逆转肝癌和食管癌等肿瘤细胞对抗癌药产生的耐药性。Shen等的研究表明哇巴因不仅可在体外逆转人食管癌耐药株EC109/CDDP细胞的对顺铂（CDPP）的耐药性并能在小鼠体内逆转EC109/CDDP细胞裸鼠移植瘤对CDPP的耐药性，并提出这种效应与哇巴因抑制β-catenin向核内的转运有关，提示哇巴因具有β-catenin依赖性抗获得性多药耐药（MDR）的作用[22]。

杨明镇等在哇巴因干预体外培养的人肝癌耐药Bel-7402/ADM(阿霉素)细胞的研究中发现哇巴因可在体外下调肿瘤细胞的多药耐药性（MDR-1）RNA的表达水平从而逆转肝癌耐药Bel-7402/ADM（阿霉素）细胞的耐药性[23]。Guo等发现哇巴因还能提高骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性，这与Ca2+通道和DNA甲基化有关[24]。另有报道哇巴因可通过抑制FA/BRCA途径而阻止DNA链间交联（ICL）的修复，从而增强顺铂和丝裂霉素C（MMC）等诱导ICL的抗癌药的细胞毒性作用，并能降低其耐药性[25]。以上研究提示哇巴因具有作为化疗增敏剂用于肿瘤治疗的潜力，但哇巴因逆转肿瘤细胞耐药性的作用和机制可能因肿瘤细胞的种类不同而有差异，其具体机制还不甚明了。

1.5 放射增敏

放疗是目前临床上广泛应用于肿瘤治疗的手段之一，其基本机制之一是利用电离辐射（IR）诱导DNA双链断裂（DSB），而非同源末端连接（NHEJ）是负责修复电离辐射（IR）诱导的DNA双链断裂（DSB）的主要途径[26-27]。近期研究提示哇巴因可以增强肿瘤细胞的对放射治疗的敏感性，其具有抑制非同源末端连接（NHEJ）的能力，从而可抑制电离辐射（IR）诱导的DNA双链断裂（DSB）的修复，进而可加强电离辐射（IR）的细胞毒性[28]，哇巴因有望作为放射增敏剂辅助治疗肿瘤。

2 总结与展望

近年来，大量研究表明哇巴因具有良好的抗肿瘤作用[29]，但大多局限于体外实验阶段，尽管Song等[30]的研究报道哇巴因在模拟肿瘤体内特性的肝癌多细胞肿瘤球体（MCTS）模型中表现出良好的抗肿瘤效应而无明显肝毒性，但其在极度复杂的人体内环境中效果如何还尚未可知。此外，哇巴因对不同肿瘤表现出的抗肿瘤效应及其机制不甚相同，虽然有报道称其对部分肿瘤表现出选择性的细胞毒作用，但也有研究[31]表明，比起肿瘤细胞，哇巴因在非肿瘤乳腺细胞中引起更大的增殖抑制和更广泛的凋亡，故哇巴因复杂的抗肿瘤机制还需要进一步探究，其应用于人类肿瘤临床治疗的可行性也还有待验证。

已发现的哇巴因直接抗肿瘤效应大多具有浓度和时间依赖性，而高浓度的哇巴因除了在机体心血管系统表现出明显毒副作用以外，与肾脏疾病的发生也密切相关[32-34]，尽管有许多报道称哇巴因抗肿瘤效应起效浓度低于有毒浓度，但其长期使用的安全性仍未可知，在此方面仍需谨慎，因此降低哇巴因用量和毒副作用而保证安全性是其应用于临床肿瘤治疗的前提。材料学高度发展的今天，将新型材料用于医疗领域已成为科学界的研究热点，有许多研究发现纳米材料用于制药可改善药物的成药性，提高药物的靶向性，还能增强药物的治疗效果并且降低其毒副作用，且目前纳米药物制剂在临床上包括肿瘤在内的一些重大疾病的诊疗中已经表现出了重要作用[35]，故将哇巴因用于抗肿瘤纳米药物制剂的研制可能具有巨大潜力。此外，哇巴因与顺铂等抗癌药物和哇巴因与MicroRNA-34等联合使用表现出的良好的抗肿瘤效应以及哇巴因的放射增强效应等，提示联合治疗策略可能是降低哇巴因用量、减小毒副作用、提高肿瘤治疗效果的有效途径，将哇巴因用作治疗肿瘤的辅助药物可能更有研究前景。

最近有报道称哇巴因可对大鼠和小鼠的免疫系统产生较复杂的影响，可引起多种免疫细胞和分子的数量和活性发生改变[36-38]，提示哇巴因的抗肿瘤效应可能还与免疫系统有关，但这些变化的具体机制尚不清楚，对肿瘤的影响也还有待探究。故研究哇巴因对免疫系统的效应和具体机制可能对进一步发掘哇巴因用于肿瘤治疗的潜力有着巨大帮助。

综上所述，哇巴因在抗肿瘤方面具有巨大的潜力，有望成为肿瘤治疗的新型药物，但其是否具有临床应用价值还需要更深一步探究。