阿司匹林生物学新作用及其对间充质干细胞功能影响的研究进展

周颖，靳继德

·综述·

阿司匹林生物学新作用及其对间充质干细胞功能影响的研究进展

周颖，靳继德

100850 北京，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所

阿司匹林又称乙酰水杨酸（acctylsalicylic acid，ASA），是一种非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAIDs），其疗效稳定、副反应少，已广泛应用于临床，预防和治疗多种疾病，如风湿疾病、心脑血管疾病及糖尿病等。百余年来，随着对阿司匹林研究的不断深入，发现阿司匹林参与了多种生物学途径，一些新的药理作用也不断被发现。

1 阿司匹林的生物学作用

1.1 抑制环氧合酶

研究发现，阿司匹林主要通过抑制环氧合酶（cyclooxygenase，COX）的活性从而抑制前列腺素（prostaglandin，PG）的合成。阿司匹林可使 COX-1 和 COX-2 不可逆的乙酰化，进而抑制 COX 活性，这也是其独一无二的特性。相关研究发现，癌细胞常产生大量前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2），减弱免疫系统对病变细胞的正常应答，而阿司匹林通过抑制 COX 来减少 PGE2 的合成，达到重新唤醒免疫系统的效果，通过将免疫疗法与阿司匹林联合使用，能够减缓癌细胞的生长[1]。因此，阿司匹林与癌症预防间的关系逐渐成为研究焦点。

1.2 抑制核转录因子

较早的研究大都集中在阿司匹林对 COX 的抑制，但后期研究表明，阿司匹林还具有抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）并诱导肿瘤细胞凋亡的作用，尤其在治疗消化道肿瘤方面有较好的疗效[2]。无论在体内还是体外实验中，阿司匹林和水杨酸钠均可抑制 IκB 激酶（IKK-β）的活性，与 IKK-β 结合后阻断其与三磷酸腺苷（ATP）的结合，继而抑制 NF-κB 转录炎症因子。还有研究显示，阿司匹林与 NO 结合后能降低 NF-κB 蛋白水平，抑制其激活，从而发挥抑癌作用[3]。

1.3 激活蛋白激酶

近几年，阿司匹林对 AMP 依赖的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）的激活作用成为研究热点[4]。AMPK 是生物能量代谢调节的关键分子，通过促进分解代谢、抑制合成代谢来调控机体细胞的生长代谢。阿司匹林在体内水解为水杨酸，水杨酸和阿司匹林均可激活AMPK。研究发现，阿司匹林对 AMPK 的活化作用很强，活化作用可长达 16 h，在 16 h 内均能抑制 S6核糖体蛋白的磷酸化，进而抑制 mTOR 的表达[5]，同时活化 AMPK，降低结直肠癌的发病率和死亡率。Hardie 等[6]发现在 AMPK 基因敲除的小鼠中，水杨酸盐增加脂肪利用和降低血浆脂肪酸的作用消失了，说明水杨酸的作用需要通过 AMPK 介导。AMPK 还可降低细胞质人抗原 R（HuR）与特定细胞的结合[7]，HuR 在细胞内起调节细胞周期和提高蛋白稳定性的作用[8]，因此，阿司匹林还可以通过 AMPK 减少 HuR 和细胞周期蛋白，进而抑制细胞增殖并诱导癌细胞的自噬。

1.4 调控炎性因子

阿司匹林对炎性因子的分泌有一定的调节作用。Kata 等[9]研究发现，阿司匹林（1 mmol/L）极大地降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻击神经小胶质细胞促炎性IL-1β 和 TNF-α 的产生，同时增加了抗炎性 IL-10 的水平。此外，阿司匹林下调一氧化氮合酶 2（nitric oxide synthase2，NOS2），激肽原基因（kininogen 1，Kng1）、IL-1β、前列腺素内过氧化物酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）或趋化因子 CCR1 等促炎基因，同时上调 IL-10、集落刺激因子 2（colony stimulating factor 2，CSF2）、趋化因子 CXCL1 等一些抗炎基因；但 Osnes 等[10]研究表明，较高浓度（> 2 mmol/L）的阿司匹林可提高单核细胞中 TNF-α 的 mRNA 水平。说明阿司匹林对炎性因子的调节存在细胞及环境特异性，其详细的调控机制尚需进一步研究。

1.5 调控细胞

阿司匹林在调控细胞生长等方面也发挥着重要作用。研究发现，服用阿司匹林的老年人认知能力下降幅度比未服药者低，从而延缓阿尔茨海默症患者认知损害的进程，这是由于阿司匹林的分解物水杨酸可以与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）结合，从而阻断其进入细胞核，抑制神经细胞的衰老和死亡[11]。另有一些研究表明，阿司匹林能够抑制多种细胞的生长，包括内皮细胞、血管平滑肌细胞，尤其是癌细胞[12-19]。

2 阿司匹林对间充质干细胞的影响

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有很强的自我更新能力和多向分化潜能，除了促进损伤组织再生修复外，还参与免疫调控，缓解多种免疫或炎症性疾病。由于 MSC 易于获得、能在体外快速增殖等特性，已成为再生医学应用于临床的重要干细胞。然而，在临床应用中，间充质干细胞的作用常受到体内炎症因子种类和水平等多种因素的影响。近年来，一系列新的研究发现阿司匹林还可以影响 MSC 的生长、分化和免疫调节等作用。

2.1 阿司匹林对 MSC 生长的影响

Du 等[20]研究表明，较低剂量（1 μmol/L，10 μmol/L）的阿司匹林能够促进小鼠骨髓基质细胞的生长和成骨分化。Zhang 等[21]使用不同剂量（0、25、50、100 μg/ml）的阿司匹林预处理骨髓干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）72 h，与对照细胞相比，50 μg/ml 的 ASA 在 72 h 时显著增加了 BM-MSC 的增殖速率。杨瑞莉等[22]研究证明 50 mg/L 的 ASA 可以提高牙龈间充质干细胞（MSCs derived from gingiva，GMSC）表面蛋白 CD146 和 CD105 的表达，促进 GMSC 的增殖。孙蕾等[23]研究显示不同浓度的阿司匹林对于人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的作用有剂量依赖性的特点，阿司匹林浓度为 0.05 mmol/L 和 0.005 mmol/L 培养 3 d 后细胞扩增趋势明显增高（< 0.05），浓度为 0.5 mmol/L 时，同对照组相比促进作用不明显，而当浓度大于 5 mmol/L 时，阿司匹林明显抑制了细胞生长（< 0.05），进而推测中高浓度的阿司匹林对 hDPSCs 可能有毒性作用。Wang 等[24]研究也证明，较高浓度的阿司匹林对 BM-MSC 的增殖具有抑制作用，MTT 结果显示，1、5 和 10 mmol/L 的阿司匹林对 MSC 增殖的抑制率分别达到 18%、37%和 62%。同位素渗入试验结果也显示，1、5 和 10 mmol/L 的阿司匹林处理后，MSC 的 DNA 合成分别被抑制了 25%、57%和 90%。Deng 等[25]研究证明高浓度（1、5 mmol/L）的阿司匹林可通过线粒体/caspase-3 途径诱导 MSC 凋亡。此外，Wang 等[26]研究表明高浓度的阿司匹林还可以诱导肌腱干细胞（tendon stem cells，TSC）的凋亡，用阿司匹林（1、2 或5 mmol/L）处理 TSC，葡萄糖合成激酶 3β（p-GSK-3β）、C-myc 和 cyclin D1 的表达呈时间和剂量依赖性降低。由于肌腱病是一种慢性炎症性疾病，患者需长期服用非甾体抗炎药，但阿司匹林的临床剂量可能会诱导 TSC 凋亡，阻碍肌腱病的恢复。上述研究表明，低浓度（< 200 μmol/L）的阿司匹林可以促进 MSC 的生长，但高浓度（> 1 mmol/L）阿司匹林对 MSC 却有抑制增殖和促凋亡等作用。因此，阿司匹林的生物学作用与处理时间以及剂量有关，并且，阿司匹林对 MSC 的调节存在细胞及环境特异性，需要进一步探索在临床治疗上 MSC 与阿司匹林的相互关系，进一步增进对阿司匹林分子作用机制的了解。目前，阿司匹林对细胞生长的影响研究都属于短期的体外研究，而其在体内的长期作用，特别是对长期服用阿司匹林的患者体内细胞的影响，还需要我们做进一步的深入研究。

2.2 阿司匹林对 MSC 成骨分化及骨再生的影响

在过去的十年中，在阿司匹林对骨骼代谢过程的调节作用方面作了大量的研究。流行病学研究表明，服用阿司匹林的患者骨矿物质密度明显高于对照人群[27]。也有研究表明，阿司匹林能够改善老年人的骨密度[28]。Yamaza 等[29]将阿司匹林处理的BM-MSC移植入免疫功能低下的小鼠体内，发现骨形成能力明显改善，并且在体外实验中，发现阿司匹林能够促进人 BM-MSC 的矿物质积累。Cao 等[30]通过小型猪模型，证明阿司匹林预处理的 BM-MSC 能够改善动物的颅骨骨再生。Zhang 等[21]的另一项研究表明ASA 预处理的骨髓间充质干细胞（ASA-BMMSC）减少了牙周炎大鼠的牙槽骨丢失。祝媛和彭良哲[31]的研究结果也证明用 ASA 处理可以促进牙槽骨再生。

相对于骨髓 MSC 来源的困难，牙源干细胞的获取较为容易，可以从正畸或智齿患者拔出的牙齿中获得，并且在体外可以诱导成骨/成牙向、神经向、血管内皮向分化，并被应用于口腔颌骨的再生和牙周炎等治疗中。研究表明，体外培养的牙髓干细胞（hDPSCs）比骨髓干细胞（BM-MSC）的骨向分化能力更强，因此，Yuan 等[32]在大鼠颅骨缺损模型中评估了阿司匹林对牙髓干细胞（hDPSCs）接种的组织工程化无机牛骨（Bio-Oss）的骨修复的影响，结果表明，阿司匹林在植入后 8 周或 12 周时显著增加了基于 hDPSC的骨形成。Tanaka 等[33]研究证明了 ASA 促进了根尖牙乳头来源的干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）的体外和体内牙源性分化，上调了牙源性 SCAP 中 AKT 的磷酸化。Abd Rahman 等[34]研究显示，在 500 和 1000 μmol/L ASA 处理下，牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的成骨率明显增高，但抑制了 PDLSCs 的增殖，其作用机制尚不清楚。通过基因表达谱分析显示 19 个差异表达的基因，其中成纤维细胞生长因子 9（FGF9），血管内皮生长因子（VEGF）、IL-2、IL-4、IL-10、BMP10、VEGFC 和 FGF2 显著上调，而 Pleotropin（PTN）、FGF5、脑源性神经生长因子（BDNF）和分泌型蛋白 Dickkopf-1（DKK1）均显著下调。这些由 ASA 上调的基因参与了细胞信号传导，血管生成，干细胞多能性，细胞生长、增殖和分化有关的生物学途径，说明 ASA 可能通过刺激 PDLSC 中特定的生长因子相关基因，增强成骨潜能，促进牙周健康。提示我们可以通过蛋白质组学和转录组谱分析，提供更多有关 ASA 对干细胞作用的研究，有利于促进再生领域的发展。Li 等[35]发现炎症微环境可以引起PDLSCs 组蛋白乙酰转移酶（general control non-derepressible 5，GCN5）表达下调，进而降低了 Dickkopf1（DKK1）的表达，DKK1 是 Wnt/β-catenin 通路的抑制剂，因此激活了 Wnt/β-catenin 途径，导致成骨分化缺陷。而阿司匹林可以提高 GCN5 的表达，抑制大鼠牙周炎的发展，并促进 PDLSCs 的成骨分化。因此，应用靶向 GCN5 的药物（例如阿司匹林）可能是治疗牙周炎的新方法，提供了组蛋白乙酰化参与调控炎症微环境中 MSC 成骨分化的一个证据，详细机制仍有待进一步研究。

上述这些研究表明，阿司匹林对 MSC 的骨形成能力具有直接的影响，阿司匹林对 MSC 的调节作用可能为骨质疏松症的治疗提供一种新方法。

2.3 阿司匹林对 MSC 免疫调节的影响

体内的炎症水平可明显损害 MSC 的功能，而阿司匹林一方面可通过抑制炎症细胞浸润的微环境作用于 MSC，另外，阿司匹林还通过直接作用于 MSC 应用于免疫相关疾病的治疗。最近的研究表明，阿司匹林可以抑制成纤维细胞[36]、内皮细胞[37]和其他细胞系的炎症反应[38]。

Liu 等[39]的研究结果揭示 ASA（10 μg/ml）增强乳牙干细胞（SHED）介导的体外 T 细胞凋亡，显著改善了乳牙干细胞（SHED）的免疫调节能力，改善小鼠的结肠炎症状。Zhang 等[40]研究表明阿司匹林（0.1 mmol/L）可显著抑制血管紧张素 II（Ang II）诱导 BM-MSCs 的 ERK1/2 和 NF-κB 活化，减少 TNF-α、IL-6、IL-1β 和 MCP-1 基因的表达，以及TNF-α 和 IL-6 的分泌。祝媛和彭良哲[31]也证明用 ASA（60 μg/ml）处理 BM-MSCs 后 TNF-α 和 IL-17 水平降低，IL-10 水平升高，说明 ASA 和 BM-MSCs 联用能够调节大鼠体内相关细胞因子的表达，并减轻炎症反应，改善实验性大鼠的牙周炎。杨瑞莉等[22]研究证明阿司匹林（50 mg/L)通过调高 Fas/FasL 信号通路 FasL 的表达促进牙龈干细胞（GMSCs）诱导 T 细胞凋亡，可以增强GMSCs的免疫抑制能力，促进 GMSCs 注射治疗小鼠肠炎疗效。熊璟等[41]研究也发现 ASA 通过促进牙龈干细胞诱导 T 细胞凋亡、抑制 T 细胞增殖的作用，增强 GMSCs 的免疫调节功能，增强 GMSCs 对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE)小鼠的治疗作用。这些研究说明了 ASA 通过调控 MSC 的相关炎性因子，参与 MSC 的免疫调节作用，需要我们进一步的探索，以优化 MSC 的免疫调节能力。

在患者体内，炎性微环境以各种急性或慢性方式存在于各种疾病中，例如牙周炎、骨折和口面部畸形。这种炎性微环境对内源性 MSC 和外源性 MSC的再生能力、成骨能力及其他潜能都受到明显的抑制。发炎部位的牙龈间充质干细胞（iGMSC）的免疫调节能力明显受到损害，Yu 等[42]发现 ASA 可以在体内和体外挽救发炎受损的 iGMSC 功能，改善 iGMSC 在结肠炎小鼠中的治疗作用。Tang 等[43]观察了阿司匹林的剂量对不同来源的间充质干细胞的影响，结果表明，50 μg/ml 和 100 μg/ml 的阿司匹林均可显著增加骨髓干细胞的 TGF-β1 产生，但只有浓度为 100 μg/ml的阿司匹林可促进牙髓干细胞（hPDLSC）的 TGF-β1 产生，说明来自不同组织来源的 MSC 对阿司匹林的刺激表现出不同的剂量反应。

2.4 阿司匹林影响 MSC 的相关机制研究

Deng等[25]研究发现阿司匹林诱导 MSC 凋亡是通过 Wnt/β-catenin 通路调节线粒体/caspase-3 的功能实现。Li 等[35]研究揭示了阿司匹林通过调节组蛋白乙酰化参与调节炎症与成骨分化的新机制，该研究发现炎症微环境引起牙周膜干细胞（PDLSCs）的组蛋白乙酰转移酶（GCN5）表达下调，进而降低了 DKK1 的表达，DKK1 是 Wnt/β-catenin 通路的抑制剂，因此激活了 Wnt/β-catenin 途径，导致成骨分化缺陷。而阿司匹林可以提高 GCN5 的表达，抑制大鼠牙周炎的发展，促进成骨分化。

Tang 等[43]研究显示阿司匹林处理的 BM-MSC 通过 15-去氧-△-(12,14)前列腺素 J2(15d-PGJ2)/过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPARγ）/TGF-β 通路参与调节性 T 细胞（Tregs）的上调与 Th17 细胞的下调。

Chen 等[44]将端粒酶活性与 BM-MSC 的免疫调节联系了起来，发现阿司匹林在改善 BM-MSC 的免疫调节能力的同时，上调了 BM-MSC 的端粒酶活性。据报道，端粒酶逆转录酶（TERT）参与多种细胞功能的调节，通过 Wnt 信号通路调节基因的转录，通过与染色质重塑蛋白 BRG1 相互作用来执行干细胞激活程序，作为转录复合物结合 FAS 配体（FASL）启动子上调 FASL 表达，从而提高免疫调节功能。Yu 等[42]研究表明 ASA 通过上调 iGMSC 中FasL的表达，从而改善 iGMSC 介导的 T 细胞凋亡和治疗小鼠结肠炎的效果。

阿司匹林对 MSC 的作用可能还存在其他的机制，需要我们进行更多的探索，随着研究的不断深入，一些新的作用将会被揭示。

3 总结

MSCs 因其具有自我更新能力和多向分化潜能，在近十年中广受科研界的重视。除了再生能力以外，MSCs 还具有强大的免疫调控能力，通过其表面分子、分泌可溶性细胞因子或通过控制其他细胞功能等多种方式来调节免疫反应，缓解或治疗免疫相关疾病。然而，由于炎症等原因，单纯的 MSC 治疗常常达不到满意的效果，通过基因修饰、联合用药、小分子化合物处理等创新策略可明显加强 MSC 的疾病治疗作用。大量实验已经证明，经过阿司匹林处理明显增强了 MSC 的成骨分化和免疫调节作用，可加强 MSC 治疗疾病的效果。但由于 ASA 在体内的半衰期较短[45]，因此制造合适的支架和递送系统，在疾病或修复部位维持 ASA 的功效至关重要。Zhang 等[46]研究证明了基于四聚乙二醇水凝胶的阿司匹林缓释系统不仅增强了 PDLSC 的成骨能力，还增加了它的抗炎特性。Li 等[47]研发了一种成骨 BFP-1 肽修饰底物（PS-PEP），并通过聚多巴胺（PDA）和羧甲基壳聚糖（CMC）技术评估了其在体外辅助成骨的作用，与原始底物相比，PS-PEP增强了阿司匹林处理的 hMSC 的成骨分化。这种新颖的策略在细胞治疗和骨组织工程中具有潜在的应用前景。

总之，阿司匹林处理有助于 MSC 治疗效果的显著改善，但仍需要进一步的研究以评估其对 MSC 在体内功能的影响，优化阿司匹林的使用剂量和时间，以促进 MSC 功效最大化。

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靳继德，Email：18612760302@163.com

2020-07-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.012