修复骨缺损的脂肪干细胞组织工程材料的研究进展

赵 鹏, 黄 东, 熊雅茹, 刘晓春, 牟 勇, 孙大炜

(1.南华大学，湖南省衡阳市 421001；2.唐山开滦总医院骨科，河北省唐山市 063000；3.广东省第二人民医院创伤骨科，广东省广州市 510000；4.广东省第二人民医院麻醉科，广东省广州市 510000)

骨缺损是骨科常见的疾病之一。少量的骨质缺损可通过自身骨再生作用进行修复，然而当骨缺损达到骨干缺损的1.5倍时，便超出机体的愈合能力。传统治疗骨缺损的方式包括自体骨移植、骨诱导膜技术等，根据临床实验结果显示，虽有一定成效，但总体治疗效果不佳。骨组织工程支架的发展，为骨缺损疾病的治疗提供新的治疗方法。用于骨缺损治疗的骨组织工程支架，其主要由两部分构成，即具有骨传导、骨诱导特性的3D生物材料支架以及各类成骨诱导因子或“种子”细胞。目前常用的也是研究最为深入的“种子”细胞为骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，但BMSCs因其获取困难，数量较少，其应用受到限制。

自2001年Zuk等[1]证实脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有与BMSCs高度相似的全能分化特性以来，对于ADSCs在骨组织工程支架应用的研究逐渐增多。进而出现许多新型骨组织工程支架，其中包括由单纯ADSCs构成的骨组织工程支架、各类药物或生长因子联合ADSCs构成的骨组织工程支架、基因修饰的ADSCs构成的骨组织工程支架。这些生物工程支架在骨缺损修复各有优势及不足，但目前尚无文章对这些骨组织工程支架进行总结。

1 ADSCs在组织工程支架构建研究中的发展

1.1 单纯ADSCs复合生物支架

自ADSCs的全能分化特性被发现以来，绝大多数的研究仍停留在细胞学及动物学层面，而用于解决临床疾病治疗的研究报道却极少。王之发等[2]放弃传统支架，将ADSCs移植于成骨性细胞膜片上使骨缺损得到良好修复。王闯健等[3]将ADSCs在特定培养液中传代培养后与喷墨全包芯骨支架复合，并移植于兔股骨骨缺损处，术后第12、24、48周发现，ADSCs骨支架移植组骨缺损区修复面积远大于未加入ADSCs的移植组。黄健萍等[4]利用壳聚糖支架复合ADSCs，将其移植于鼠颅骨骨缺损模型，同样证实ADSCs的促进骨修复作用。目前，已证实可与ADSCs复合并对骨缺损修复具有促进作用的支架除传统的脱钙骨、β-磷酸三钙支架以外，还包括如明胶海绵、纳米胶原骨材料支架、纤维蛋白胶、生物性玻璃以及含锶离子支架Sr10-HA-PBLG等新型材料。

通过改变不同生物工程支架为ADSCs提供成骨诱导环境，减弱ADSCs的成脂作用，提高其成骨特性，使ADSCs在骨缺损修复领域的作用得以肯定。单纯依靠生物工程支架所提供的成骨微环境不能使ADSCs成骨分化作用稳定维持。

1.2 药物、生长因子等联合ADSCs生物骨支架

1.2.1 中药提取物 中成药物研究的发展，为骨组织工程支架提供新的思路，Ding等[5]、刘宁等[6]两位学者分别利用续断、皂苷Ⅵ、淫羊藿苷与ADSCs复合后种植于无机物支架，并在动物骨缺损模型中收到良好治疗效果。但中成药成分复杂，局部的应用是否对机体造成影响，并未有相关报道。

1.2.2 生长因子 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前成骨作用最强的一类生长因子，为TGF-β超家族的一员，能上调成骨相关基因的表达，促进成骨细胞成熟。研究显示，不同浓度的BMP会对间充质细胞产生不同的效果，低浓度BMP能够诱导间充质细胞向骨组织形成区移行，中等浓度BMP可促进间充质细胞向成软骨及成骨细胞方向分化，而高浓度BMP能促进间充质细胞的增生。丁涛等[7]将BMP-14与ADSCs共同复合于羟基磷灰石/丝素蛋白上，而后移植于大鼠尾骨骨缺损模型，使大鼠尾骨骨缺损处得以良好愈合。但BMP对ADSCs复合材料的实验研究更多的是软骨修复方向，而骨缺损修复的相关研究相对较少，且大多处于细胞学实验层面。

1.2.3 富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRP) PRP这一概念最早由Hood等于1993年首先提出，是含有血小板超过生理水平至少4倍的血浆，其组成成分复杂，主要修复机制为释放生长因子PDGF和TGF-β以促进组织的修复再生。根据所含白细胞的多少，PRP可分为贫白细胞PRP和富白细胞PRP两种，相对于贫白细胞PRP而言，富白细胞PRP可能有更好抗炎作用，因为白细胞释放出的递质会诱导多种细胞聚集和黏附以利于修复作用。目前为止，PRP的制备方法无统一的标准，其制备主要有密度梯度离心法、血浆分离置换法两种方式。密度梯度离心法是根据血液中各组分沉降系数的不同，在全血加入抗凝剂后进行低转速离心使全血分为四层，此方法得到的为贫白细胞PRP，此种方法由Anitua发明。而现在所用的多为二次离心，即在第一次离心后将血液分成3层，取交界处的一层进行二次离心，最终获得的为富白细胞PRP。PRP在骨缺损修复方面具有良好疗效。PRP与ADSCs共同复合骨组织工程支架治疗骨缺损的研究目前较少，Feng等[8]将PRP与ADSCs共同复合于β-TCP支架移植于兔下颌骨缺损模型中，最终收到良好治疗效果。Cruz等[9]将人脂肪干细胞、犬自体富血小板血浆凝胶支架用于修复比格犬胫骨缺损，与自体骨移植组相比，实验组有更多的骨形成和骨成熟。

1.2.4 化学有机物 相对于早期单纯ADSCs移植而言，在ADSCs中加入其他具有促成骨分化作用的物质，可为ADSCs的分化提供较为持久的成骨诱导环境，文进等[10]利用Exendin-4与ADSCs共培养修复小鼠股骨骨缺损，发现Exendin-4能够明显促进ADSCs向成骨细胞分化,促进骨形成。赵亚杰等[11]利用氯化钙与ADSCs共同培养修复大鼠骨缺损模型，同样收到良好效果。

生长因子及药物的半衰期短，移植入动物模型后在短时间内可促进ADSCs的成骨分化作用，一旦生长因子及药物衰减代谢至较低水平时，其诱导环境便遭到破坏，且不能进行持续添加。因此调控性较差，持续诱导作用仍较为短暂，以至于干细胞整体利用率较低。复合的生长因子及药物本身具有成骨诱导作用，虽然实验结果可见成骨作用增加，但究竟是复合的物质影响ADSCs成骨分化还是ADSCs的加入增强复合物质的成骨促进作用尚不明确。

1.3 基因修饰ADSCs细胞生物支架

基因工程技术的成熟，为生物骨支架的构建提供了优质的“种子”细胞。Li等[12]早在2007年通过慢病毒将BMP-2转入ADSCs中，结合β-磷酸三钙支架，移植于犬尺骨骨缺损模型中，在术后16周，X线、组织学和组织形态学分析表明，相对于未转染基因的ADSCs移植组，BMP-2基因修饰的ADSCs产生了新形成的骨面积显著增加，所有的骨缺损愈合。Chiarella等[13]发现敲除锌指蛋白521(Zinc finger protein 521,ZNF521)可显著促进人脂肪干细胞成骨分化，增加晚期矿化骨结节的积累。除上述基因外，目前实验证实的可促进ADSCs成骨分化的基因有Cbfa-1、US2/US3、抗miR-26a-5p、rhPDGF。

相较于复杂的转基因技术，向干细胞培养基中加入细胞因子，同样可增加脂肪干细胞成骨分化。Yanai等[14]研究表明，在ADSCs培养基中添加rhBMP-2的培养基,可明显提高成骨相关蛋白表达，促进人脂肪干细胞成骨分化。

2 ADSCs复合骨组织工程支架的探讨

2.1 ADSCs复合骨组织工程支架应用的可行性

ADSCs作为一类干细胞，具有良好的自我更新能力、增殖能力、全能分化能力，其遗传稳定性良好，实验证明体外传代培养13～15代时可依然保持其稳定的生物学特性，增殖能力优于骨髓间充质干细胞[15-17]。并且ADSCs获取途径十分容易，通过在抽取后的脂肪组织中加入胶原酶，梯度离心酶解后脂肪悬液便可获取。

ADSCs经过体外诱导，可分化为不同类型的细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。向培养基中加入地塞米松，可使其分化后的细胞表达成骨细胞标志物ALP。但研究表明，其成骨分化方向与加入的诱导剂浓度有关，例如，加入1 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可诱导其成骨方向分化，而加入1 000 μg/L的bFGF，其成脂分化作用显著。虽然目前对ADSCs的研究目前仍处于起步阶段，但其具有获取简单，增殖能力强，具有全能分化特性等优点，且各种骨缺损修复实验结果均显示其具有良好的治疗效果，因此，ADSCs为骨缺损的治疗提供了新的思路。

2.2 ADSCs复合骨组织工程支架的优点

ADSCs复合骨组织工程支架的发展大致经历三个阶段。第一阶段为尝试阶段，单纯将体外经过成骨诱导分化后的ADSCs与组织工程支架相结合，并进行动物学实验。第二阶段为细胞学层面改良阶段，将具有成骨诱导作用的物质如药物、生长因子等加入到ADSCs复合骨组织工程支架中，为其提供持续的骨诱导环境，但骨诱导持续时间仍较为短暂。第三阶段，也是目前研究所处阶段，即对ADSCs在基因层面进行改良，将具有成骨诱导基因转入ADSCs中，使其源源不断的产生成骨诱导因子以促进ADSCs成骨分化，但仍存在诸多问题以待解决。

在第一阶段中，单纯利用体外成骨诱导后的ADSCs，因单纯的组织工程支架其成骨诱导作用微弱，无法为ADSCs提供持续的骨诱导环境，虽然对组织工程支架进行改良，如由最初的羟基磷灰石支架再到脱细胞骨基质支架再到聚乳酸支架。但单独依靠支架所提供的成骨微环境不足以使增殖后ADSCs持续成骨分化，势必ADSCs成骨分化作用逐渐减弱。而利用体外物理干预如使用540 s波长为660 nm的红光照射，虽在动物骨缺损模型中收获可观效果，但能否用于临床骨缺损疾病的治疗需进一步实验证实。

相对于第一阶段的单纯移植，第二阶段在ADSCs骨组织工程支架中加入其他成骨诱导因子，虽延长了成骨诱导时间，但生长因子在体内半衰期较短，仍无法保证在骨修复全过程中对ADSCs进行成骨诱导。中药对疾病的治疗在中国已有几千年历史。近年来，在ADSCs骨组织工程支架中加入中药提取物如杜仲醇、断续、皂苷等，并对动物骨缺损的修复得到了乐观的效果。但迄今为止，尚无临床实验证实其局部应用的生物安全性。

由于基因工程技术的发展，ADSCs骨组织工程支架可以为ADSCs提供持续的成骨诱导环境。目前常用的病毒转染方法有两类，一是慢病毒转染，另一种是腺病毒转染。两种转染方式，均能高效地将目的基因转入ADSCs中，能使目的基因持续稳定的表达。但两种方法也存在一些不同，例如慢病毒载体转染效率低于腺病毒转染，腺病毒转染无法将目的基因重组至细胞基因组上，而慢病毒可以做到，但有可能发生重组的危险。通过腺病毒及慢病毒转染技术，将已知且明确的成骨相关基因转入ADSCs中，可以很好地解决外源性生长因子及药物浓度随时间逐渐递减问题，极大的促进ADSCs的成骨分化作用同时也为其提供稳定、持续的成骨诱导环境。虽然其具有诸多优点，但存在的问题未能在文章中进行探讨，如转染后ADSCs表型如何进行稳定，使其保持自身的干细胞特性，何种转染方式可降低对种子细胞的毒性，以及如何提高干细胞的转染效率等。

2.3 ADSCs复合骨组织工程支架的局限性

目前对脂肪干细胞所构建的组织工程骨支架的研究仍局限于细胞学或动物实验阶段。体外及动物和人体内微环境的差异无法将研究结果推广致临床骨缺损的治疗。由于各个研究中所用的脂肪获取位置、提取、分离、培养方法及应用剂量等无统一标准，且ADSCs表面不具有独特细胞分子，因此提取出ADSCs纯化度不高，导致ADSCs向骨细胞分化的效率低下。ADSCs仍处于试验阶段，其用于临床骨修复的报道相对较少。且临床应用多为修复颌面部骨缺损，而四肢骨缺损的治疗尚未有明确报道。Castillo-cardiel等[18]报道其利用ADSCs治愈下颌骨缺损，Khojasteh等[19]也将ADSCs用于下颌牙槽嵴萎缩患者并取得良好的治疗效果。虽然以上研究报道利用ADSCs治疗骨缺损获得良好效果，但其临床安全性仍备受争议。

3 总结与展望

查阅国内外最新文献，发现近年来对ADSCs骨缺损修复材料的研究逐渐深入，但临床应用较少，因此，要加快实验成果转化速度，尽早实现实验室研究成果应用到临床疾病的治疗，减轻骨缺损患者的痛苦。但总体来说，ADSCs是一种理想的骨组织工程支架种子细胞。