microRNA-34a应用于消化道肿瘤治疗的研究进展

韩懿存，范修琦，陈玉龙，王 歌，郭兰伟，石 变，高启龙

1)河南中医药大学 郑州450018 2)郑州大学附属肿瘤医院中西医结合科 郑州 450003

消化道肿瘤是指发生在食管、胃、肝脏、大肠、小肠等部位的一类肿瘤。最新癌症统计数据[1-2]显示，我国消化道肿瘤的发病率明显高于世界平均水平，且多为恶性肿瘤，由于早期症状隐匿，此类肿瘤被发现时往往处于晚期[3]。手术、放化疗等标准治疗方案具有一定局限性，目前已达治疗瓶颈，迫切需要开发更多的癌症治疗策略，以改变现状。

microRNA是一种具有多种功能的微小非编码RNA，几乎在所有已知的癌症中都有发现[4]。microRNA-34a(miR-34a)最先被描述为潜在的肿瘤抑制因子[5]，属于包括miR-34b和c在内的肿瘤抑制基因miR-34簇，由位于1p36的基因编码，是肿瘤抑制蛋白P53的直接转录靶点[6]。miR-34a在靶基因序列中的短结合基序有利于其同时靶向多个促肿瘤转录物，负调控数百个基因的mRNA，具有广谱靶点的特点，目前已有超过77个靶点被挖掘，如细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、MET、c-Myc、E2F3/5、Bcl-2、Notch-1等[7-9]。近年来有研究[10-14]证实miR-34a与放化疗联合具有协同增效作用。此外，其在恶性程度更高、侵袭性更强的晚期癌组织中表达更低[15-17]，有望成为辅助早期诊断、评估预后的生物标志物[16,18]，为临床提供指导。

本文主要针对miR-34a在消化道肿瘤治疗中的作用机制和研究进展进行了综述。

1 miR-34a在消化道肿瘤治疗中可能的作用及机制

1.1阻滞细胞周期众所周知，细胞周期受到机体多种因素的严格调控，周期蛋白异常可导致细胞恶性增殖，从而继发肿瘤。研究[19-20]证实，miR-34a模拟物可使结直肠癌细胞在G0/G1期聚集，使处于S期的细胞数量明显减少；转染miR-34a抑制剂可逆转miR-34a对细胞周期的阻滞作用；其具体机制可能为miR-34a通过直接调节CDK4和CyclinD1的表达，从而达到调节细胞周期的目的。在肝癌HepG2细胞中，miR-34a可下调细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6的表达水平[21]。上述研究结果表明miR-34a可能起到类似CDK4/6抑制剂的作用，通过阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞的无限增殖。

1.2促进肿瘤细胞凋亡肿瘤细胞周期被阻滞后可诱导细胞凋亡，该过程在生物体内发挥着积极作用，但发生机制较为复杂，其中凋亡因子Caspase及凋亡抑制因子Bcl-2家族至关重要。研究[22-23]表明,转染miR-34a模拟物后，食管鳞状细胞癌细胞内PARP、Bax、Caspase-3和Caspase-7的表达水平升高，而Bcl-2表达水平降低，miR-34a可通过调节凋亡蛋白的表达促进食管癌细胞凋亡。Survivin作为Caspase的上游基因能直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性；miR-34a能直接抑制胃癌细胞中Survivin的表达，从而释放Caspase活性,促进细胞凋亡；miR-34a还可抑制Rb磷酸化，阻滞细胞G1/S期转换，启动凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖[24-25]。miR-34a的促凋亡作用在直肠癌中也得到了证实[26]。

1.3影响肿瘤上皮细胞-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)EMT的发生预示肿瘤的恶性进程，是肿瘤转移机制的重点。发生EMT的细胞获得迁移和侵袭能力后，可从周围微环境中扩散出来并降解，从而释放大量间充质蛋白，如波形蛋白、纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、MMP等，从而导致肿瘤进一步发展[27]。目前有证据[23, 28]证实miR-34a参与了EMT进程，通过抑制EMT相关蛋白的表达，负调控多条信号通路，发挥抗肿瘤作用，常见的信号通路有TGF-β/Smad、Wnt、Notch及PI3K/AKT/mTOR[29-30]。Qiao等[17]证实过表达miR-34a可以通过TGF-β/Smad信号通路使EMT诱导转录因子Snail蛋白表达水平降低，抑制肝癌细胞的EMT进程。Notch1及其配体Jagged1的激活可诱导EMT并促进大肠癌细胞的侵袭和扩散，miR-34a则可与Notch1、Jagged1相互拮抗，提示miR-34a与Notch1/Jagged1通路在肿瘤EMT进程中关系密切[31-32]。miR-34a影响EMT的作用机制众多,如负调控CD44抑制肿瘤细胞的黏附能力[33]、负调控与炎症相关的IL-6R/STAT3/miR-34a 反馈环[34]等，在抑制癌细胞恶性迁移方面发挥了至关重要的作用。

1.4抑制肿瘤干细胞的自我更新和分化肿瘤干细胞假说为肿瘤治疗提供了一个重要思路。成功的癌症治疗不仅应针对增殖的癌细胞，还应针对静止的肿瘤干细胞[35]。Wang等[36]和Jang等[37]发现miR-34a可通过下调原癌基因B细胞特异性小鼠白血病病毒整合位点1(BMI-1)和CD44的表达，负性调控胃癌细胞的干细胞样特性，抑制肿瘤干细胞分化，阻止肿瘤的发展和扩散。miR-34a还可通过Notch信号通路调控结肠癌干细胞的分裂进程[38]。关于此类作用机制的报道尚不完善，但可以推测miR-34a在肿瘤干细胞自我更新和分化中起到了积极作用，这还需进一步找寻靶点深入研究。

1.5调控肿瘤免疫随着肿瘤免疫疗法的兴起，研究者们也开始关注miRNA的免疫学效应。首个miR-34a脂质体模拟物(MRX34)的Ⅰ期临床试验结果显示：MRX34增加了肿瘤浸润淋巴细胞的数量，减少了调节性T细胞(Tregs)的数量,降低了PD-1和PD-L1的表达，提示miR-34a可能在免疫治疗中直接发挥作用[39]。其机制有以下几个方面：miR-34a直接靶向PD-L1抑制其表达[40]，促进T细胞活化[41]，激活核转录因子κB(NF-κB)信号通路调节T细胞功能[42]，靶向CCL22趋化因子抑制其招募Tregs[43]，促进树突状细胞成熟[44]等，从而防止肿瘤的免疫逃逸。可见以miR-34a作为干预靶点调节T细胞的免疫反应性、抑制免疫逃逸可能是一个全新的抗肿瘤思路[45]。作为T细胞调控网络的主要环节，miR-34a在肿瘤免疫逃逸方面的作用值得深入探究。

2 miR-34a在消化道肿瘤治疗中的新进展

2.1miR-34a与放化疗结合miR-34a与肿瘤放疗的结合：放疗是治疗消化道肿瘤的有效方法之一，但经过多次放疗后的辐射抵抗是治疗失败的主要诱因。miR-34a可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转食管癌Ec109细胞的辐射抗性，显著抑制肿瘤细胞的生长[46]。Liu等[47]证实miR-34a过表达可明显增加小鼠对γ辐射治疗的敏感性，其机制可能与miR-34a直接靶向人类癌细胞放射敏感性的关键分子Bcl-2有关。Lacombe等[48]详细介绍了miR-34a在消化道肿瘤放疗中的作用，认为无论是在癌细胞中作为辐射增敏剂，还是在正常细胞中作为辐射防护剂，miR-34a均发挥了重要作用。miR-34a有望为未来消化道肿瘤更精确的放疗做贡献。

miR-34a与肿瘤化疗的结合：Zhang等[10]报道91例Ⅱ/Ⅲ期大肠癌患者接受了以氟尿嘧啶(5-FU)为基础的辅助化疗，高表达miR-34a的患者3 a复发率低于低表达患者；无论疾病分期如何，miR-34a高表达患者从以5-FU为基础的化疗中的获益均大于miR-34a低表达患者；miR-34a可以使5-FU耐药的结肠腺癌DLD-1细胞对5-FU重新增敏。后续报道[49-50]指出此种增敏机制可能是通过靶向高迁移率族蛋白1(HMGB1)抑制自噬和通过DLL1/Notch途径抑制ABCG2实现的。此外，miR-34a与其他化学药物的结合如奥沙利铂、阿霉素、紫杉醇等也能达到增敏效果[21,51-53]。

2.2miR-34a与其他miRNA联合不同的miRNA可通过共同的靶基因或通路协同发挥作用[54]。Jiang等[8]发现miR-34a/b/c同时缺失会促进肠腺瘤细胞增殖，抑制其凋亡，并伴有明显的细菌浸润；同时上调miR-34a/b/c表达，可抑制APC基因缺失所致的肿瘤细胞增殖，并且降低肿瘤细胞的化疗耐药性。Orellana等[55]通过对miRNA文库的无偏筛选和信息学分析，寻找到5种与miR-34a联合具有较高抗细胞增殖活性的miRNA：miR-6715b、miR-4664-3p、miR-3157-3p、miR-5100和let-7a-2-3p。其中let-7a与miR-34a在肝癌中具有协同抑瘤作用[54]。

2.3miR-34a作为诊断和预后预测标记物的潜力寻找可靠的生物标志物来预测预后，不仅有助于疾病诊断，而且有助于制定更适宜的治疗方案。Jin等[18]认为可通过消化道肿瘤患者体内miR-34a水平评估预后。Lin等[56]对101例食管癌、31例良性疾病患者和97例健康对照者体内miR-34a表达水平进行了分析，结果显示，血浆miR-34a水平可以用于识别早期(Tis+Ⅰ+Ⅱ期)食管癌，敏感度和特异度分别为66.47%和60.42%。与其他肿瘤标志物联合检测有利于食管癌的早期诊断[57]。不仅如此，有证据[51]表明miR-34a还可预测奥沙利铂对大肠癌患者的治疗疗效，这种非入侵的诊断方法有利于在治疗早期鉴别耐药患者。

3 展望

miR-34a作为肿瘤标志物，有望广泛应用于消化道肿瘤的诊断、预后判断和疗效评估，但还需扩大样本量评价其特异度和敏感度。miR-34a作为潜在的肿瘤靶向治疗候选基因，具有广阔的应用前景[58]。Jia等[59]在溶瘤柯萨奇病毒B3(CVB3)基因组中插入miR-34a靶序列，该载体在荷瘤小鼠体内保持了很强溶瘤活性，且对正常组织的毒性很低，这种安全有效的抗癌方法有望应用于消化道肿瘤的治疗。Gibori等[60]构建了miR-34a-siRNA复合物应用于胰腺导管腺癌，发现其可抑制肿瘤细胞癌基因myc的表达，展现出强大的抗肿瘤效应。此外，创新miR-34a药物递送系统，增加其抗肿瘤活性并减少其副作用[61-64]也是研究方向之一。未来，我们不仅要关注miR-34a本身，还要关注它与其他药物联合使用的治疗潜力，与放化疗结合增敏有望突破目前的治疗瓶颈。近年来随着抗PD-1/PD-L1单抗的应用，miR-34a与免疫治疗之间的关系可能是一个很好的研究方向，有望在消化道肿瘤治疗方面取得新的进展。