播种至苗期不同阶段低温对玉米幼苗生长及生理抗性的影响

菅立群 张翼飞 ，2 杨克军 ，3 王玉凤 ，2 陈天宇 张继卫 张津松 李 庆 刘天昊 肖珊珊 彭 程 王宝生

（1黑龙江八一农垦大学农学院，163319，黑龙江大庆；2黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室，163319，黑龙江大庆；3北大荒现代农业产业技术省级培育协同创新中心，163319，黑龙江大庆；4黑龙江省七星泡农场，161435，黑龙江黑河；5黑龙江省鹤山农场，161443，黑龙江黑河）

东北地区是我国最大的玉米产区，在国家粮食安全保障战略中占有重要地位。在未来气候变暖背景下，虽然东北地区热量条件总体上有利于玉米生产，但低温冷害仍是影响东北地区特别是黑龙江和吉林北部玉米生产最重要的农业气象灾害之一[1-2]，且以生育早期（播种－七叶）和生育后期（乳熟－成熟）为主要发生阶段[3-4]，现已成为寒地玉米全程机械化高效生产的关键瓶颈之一，制约着区域玉米产业持续增效与可持续发展。

已有大量研究表明，播种至萌发期低温冷害会引起玉米种子内各种淀粉分解酶活性下降，导致种子发芽率显著降低、出苗时间延迟、出苗率下降，不利于高产群体的建成[5]，且幼苗生长活力及叶片光合作用性能随之减弱[6-7]。同时，在玉米苗期，低温胁迫会抑制植株生长发育进程，影响生物量积累与分配发生变化，且幼苗素质明显下降[8-9]。此外，遭遇低温冷害后，玉米植株可通过改变体内渗透调节物质含量，促进细胞液浓度提高与降低渗透势，缓解细胞因失水过多造成的损伤[10]。

玉米播种后的田间温度环境是动态变化的，而针对低温冷害对玉米萌发与幼苗生长影响的报道大多是在恒定的适宜温度条件下开展的，难以准确解析玉米幼苗生长及群体建成对田间阶段性低温冷害的响应机制。鉴于此，本研究基于寒地典型玉米种植生态区的气象条件，在播种至苗期分阶段进行人工模拟低温胁迫环境，通过探讨玉米出苗进程、主要农艺性状及相关抗性生理指标的变化差异，明确播种至苗期阶段性低温和低温持续时间对玉米幼苗建成的影响规律，为不断创新寒地玉米全程机械化丰产增效关键技术、改善农田管理措施及防灾避灾能力、科学合理应对气候变化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米品种为先玉335（由铁岭先锋种子研究有限公司选育），供试土壤取自黑龙江八一农垦大学试验实习基地（大庆）农田0～20cm耕层，土壤类型为草甸土，基本理化性质为：碱解氮104.46mg/kg，速效磷11.47mg/kg，速效钾113.73mg/kg，有机质26.59g/kg，pH值8.06。

1.2 试验设计

试验于2018年在黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室进行，选取长势饱满、大小均匀一致的玉米种子，播于装有1 600g风干土的PVC培养钵（长×宽×高：13.5cm×13.5cm×12.0cm）中，每钵播种16粒，播深4cm。播后采用称重法进行统一均匀灌溉，然后置于温度（-10～45）±0.5℃、湿度（10%～95%）±3%、光量子密度450µmol/(m2·s)的人工气候箱中进行低温模拟试验。根据黑龙江省典型玉米种植生态区2008-2017年的气象资料数据所拟合的春季耕层0～5cm土壤温度日变化趋势（图1），动态模拟播后至苗期玉米生长温度环境，采用二因素完全随机设计，分别设置低温处理阶段和低温持续时间处理。低温处理阶段设置播后第 1～5（P1）、6～10（P2）、11～15（P3）、16～20（P4）、21～25（P5）、26～30（P6）天 6个阶段，低温持续时间分别设置4℃低温处理0（D0）、1（D1）、2（D2）、3（D3）、4（D4）、5d（D5）6个水平，以0d（常规温度）培养为对照（D0），总计31个处理组合，且均为4次重复，每个培养钵作为1次重复。试验过程中，控制人工气候箱湿度为（60±5）%，光照强度为 450µmol/(m2·s)，光照时间为12h/d，每隔1d进行统一补水。播种后，每天记录各处理组合幼苗的破土和出苗情况，于播后第35天选取各培养钵具代表性植株6株，检测功能叶片叶绿素含量与叶绿素荧光参数，并对幼苗形态和抗性生理指标进行测定。

图1 春季日平均地温变化趋势及温度人工模拟条件Fig.1 Variation trend for the daily average ground temperature in spring and the artificial simulated conditions of temperature

1.3 测定项目与方法

1.3.1 出苗进程的观察 自播种之日起每天观察、记录破土及出苗数，以幼苗出土2cm为出苗标准，统计出苗数量稳定时所经历的天数，出苗速率=1/出苗持续天数[11]。以出苗后能继续生长，并且在播种后35d仍存活的幼苗定义为成苗，成苗率=成苗数/播种数×100%[12]。

1.3.2 叶片叶绿素含量及叶绿素荧光参数的测定选定玉米幼苗最新完全展开功能叶片，将叶片暗适应30min后，利用叶绿素脉冲制荧光分析仪OS-30p（Opti-Sciences，美国）分别测定叶片上、中、下3部分的叶绿素荧光参数，分别读取初始荧光Fo，待Fo稳定后照射饱和脉冲光，获得最大荧光Fm，并计算最大光化学效率（Fv/Fm），Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm；于相同位置利用叶绿素仪SPAD-502 Plus（Konica Minolta Sensing，日本）同步测定相对叶绿素含量（SPAD值），最后取平均值[13]。

1.3.3 幼苗形态指标的测定 首先使用自来水将幼苗根部土壤缓慢冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，然后使用直尺测量具代表性植株的株高、初生胚根长、胚芽鞘长度、叶片长度和宽度，用游标卡尺测量茎基部直径；采用长宽系数法（长×宽×0.75）计算叶面积[14]。

1.3.4 植株鲜重、干重及贮藏物质运转率的测定将取样的植株分成地上部、地下部和残留种子3部分，使用Presica LS120A万分之一天平分别称量鲜重后，置于牛皮纸袋中于105℃杀青30min，然后置于80℃下烘干至恒重后称重，并计算贮藏物质运转率，贮藏物质运转率=幼苗干重/（幼苗干重+残留种子干重）×100%[15]。

1.3.5 抗性生理指标的测定 参照李合生[16]的方法，用0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.8）研磨提取，采用硫代巴比妥酸显色法测定叶片中丙二醛含量；采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，在630nm波长下测定样品的吸光度，利用蔗糖标准曲线，计算可溶性糖的含量；用3%的磺基水杨酸提取，酸性茚三酮显色后加入甲苯萃取，采用分光光度法测定脯氨酸含量[17]；采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量，在595nm下比色测定吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量mg/(g FW)[18]。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 22.0进行数据的统计分析，通过Duncan多重比较和t检验分析不同处理的影响差异，利用多因素方差分析因素间的交互效应，运用Microsoft Excel 2003及Origin 2018绘制图表。

2 结果与分析

2.1 播后不同阶段低温与低温处理时间对玉米出苗进程的影响

2.1.1 出苗速率 随着播后不同阶段低温处理时间的延长，玉米的出苗速率逐渐下降，且各阶段均在D5处理下达最低值（图2）。从表1可以看出，低温处理阶段、低温持续时间单因素对出苗速率的影响均达极显著水平，但二者的交互效应并不明显，其中P4和P5处理下的出苗速率分别较P1、P2、P3和P6下降了5.01%～13.13%、2.73%～11.04%，D0、D1和D2处理下的出苗速率分别较D4和D5高出15.06%和15.88%、7.29%和8.06%、4.94%和5.69%，且均达显著水平。从不同处理组合来看，P4D5处理的出苗速率最低，为0.038，除了与P2D5（0.0409）、P3D5（0.0418）、P4D2（0.0418）、P4D3（0.0400）、P4D4（0.0387）以及 P5D2（0.0418）、P5D3（0.0413）、P5D4（0.0396）、P5D5（0.0396）处理差异不明显以外，较其他处理显著降低了11.24%～22.34%。

图2 各阶段不同低温持续时间对玉米出苗速率的影响Fig.2 Effects of different low temperature durations at different stages on seedling emergence rate of maize

表1 不同阶段低温处理、低温持续时间对玉米幼苗出苗速率和成苗率的交互效应Table 1 Interactive effects of low temperature treatment phases and durations on maize seedling emergence rate and survival rate

2.1.2 成苗率 如图3所示，玉米成苗率仅在P3D5、P4D3、P4D4、P4D5和P5D5处理明显低于对照处理，其他处理组合间无明显差异。从播后不同阶段低温处理、低温持续时间单因素影响方面来看，低温持续时间对玉米成苗率影响达极显著水平，随着低温持续天数的增加，玉米成苗率呈现逐渐下降趋势，D4和D5分别较D0、D1和D2处理明显降低了5.35%～10.06%和8.34%～12.91%（表1）。

图3 各阶段不同低温持续时间对玉米成苗率的影响Fig.3 Effects of different low temperature durations at different stages on seedling survival rate of maize

2.2 播后不同阶段低温与低温处理时间对玉米幼苗形态指标的影响

如表2所示，低温处理阶段及低温处理时间单因素对玉米幼苗株高、茎基部直径、叶面积、胚芽鞘长和初生胚根长的影响均达显著（P＜0.05）或极显著水平（P＜0.01）。P1和P2阶段随着低温处理天数的增加，幼苗株高、茎基部直径变化幅度较小，而在P3～P6阶段，株高和茎基部直径总体上明显受低温处理影响，以P4D5处理的株高和茎基部直径最小，比对照处理分别下降了26.89%和19.54%。同时，相比于对照处理，P1～P6阶段低温处理后的幼苗叶面积和初生胚根长均有所减小，叶面积降幅分别为12.40%～28.11%、17.69%～29.10%、18.94%～29.14%、31.96%～48.07%、22.57%～39.56%和16.29%～34.31%，初生胚根长降幅分别为10.73%～31.35%、18.37%～30.01%、18.65%～37.59%、26.86%～42.15%、21.32%～37.31%和23.07%～38.36%，且均达显著水平；而胚芽鞘长仅在P3D5、P4D3、P4D4和P4D5处理组合下有明显的增长趋势。从两因素互作方面来看，低温处理阶段与低温处理时间仅对幼苗叶面积大小具有极显著的交互效应。

表2 不同阶段低温处理和低温持续时间对玉米幼苗形态指标及生物量积累的影响Table 2 Effects of low temperature treatment phases and durations on morphological parameters and biomass accumulations of maize seedlings

2.3 播后不同阶段低温与低温处理时间对玉米幼苗生物量的影响

低温处理阶段、低温处理时间单因素对玉米幼苗植株鲜重和贮藏物质转运率的影响达极显著水平（P＜0.01），植株干重仅受低温处理时间的显著影响（P＜0.05）（表2）。尽管播后不同阶段植株鲜重、干重和贮藏物质转运率总体表现为D0＞D1＞D2＞D3＞D4＞D5，但各阶段不同低温处理时间的影响程度存在差异，其中植株鲜重在P2阶段D4～D5处理、P3阶段D3～D5处理、P4阶段D2～D5处理、P5阶段D3～D5处理、P6阶段D4～D5处理比对照处理分别显著（P＜0.05）降低了0.291～0.316、0.271～0.349、0.420～0.680、0.296～0.547和 0.322～0.354g，植株干重分别显著降低了0.042～0.056g、0.034～0.041g、0.039～0.078g、0.040～0.064g 和0.044～0.049g；此外，种子贮藏物质转运率以P4D5处理最低，除与P4D3、P4D4、P5D4和P5D5差异不明显外，显著低于其他处理19.88%～33.72%。

2.4 播后不同阶段低温与低温处理时间对叶片相对叶绿素含量及叶绿素荧光参数的影响

从图4和表3可以看出，低温处理阶段及低温持续时间单因素对玉米幼苗叶片SPAD值和Fv/Fm均具有极显著（P＜0.01）影响，且低温处理阶段与低温持续时间处理对叶片SPAD值的影响存在显著（P＜0.05）的交互效应。随着低温处理时间的延长，叶片SPAD值和Fv/Fm表现为逐渐下降的趋势，而低温处理阶段单因素影响总体表现为P1＞P2＞P3＞P6＞P5＞P4，其中在P1和P2阶段D3～D5处理、P3阶段D2～D5处理下叶片SPAD值明显低于对照处理，而P4～P6阶段各低温持续时间处理均显著下降，其中P4D4和P4D5处理组合的SPAD值相对较低，分别为26.79和25.79。而在P4～P6阶段低温处理影响下的Fv/Fm降幅为4.17%～6.65%。

图4 不同阶段低温处理及低温持续时间条件下叶片叶绿素含量及最大光化学效率Fig.4 Leaf chlorophyll content and maximum photochemical efficiency of maize seedlings effected by low temperature with different phases and various durations

2.5 播后不同阶段低温与低温处理时间对玉米幼苗抗性生理指标的影响

随着玉米播后至苗期低温处理阶段的推迟，以及低温持续时间的延长，叶片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量呈逐渐增加趋势（图5），且可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量均受低温处理阶段、低温处理天数单因素的极显著（P＜0.01）影响，同时两因素的互作效应亦达极显著水平（表3）。其中，叶片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量在D5处理时达到峰值，分别较D0处理高57.99%、149.44%、65.32%和62.97%；低温处理阶段单因素的影响总体表现为P4＞P5＞P6＞P3＞P2＞P1，P4和 P5阶段的叶片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量较其他处理分别增加了0.17～0.47mg/g、0.02～0.31mg/g、0.36～5.61µg/g 和 0.21～1.10μmol/g，且均达显著水平。

3 讨论

东北地区，特别是黑龙江省玉米生产中常发生春季低温冷害，影响玉米高产群体建成和产量稳步提升。玉米种子的萌发不仅需要足够的水分和充足的氧气环境，适宜的温度条件也至关重要。低温逆境除了抑制玉米种子的萌发进程，还会影响出苗整齐度，降低成苗率[19]。本试验中，P1阶段1～4d的低温处理对出苗速率影响不显著，说明在种子物理吸涨过程中遇到低温逆境对玉米出苗速率影响较小，但在破土前后的P3和P4阶段，低温对出苗速率的影响非常明显，而P6阶段由于已完成出苗，出苗速率未受到低温处理的影响。同时，本试验中玉米成苗率主要随低温持续时间的增加呈显著下降趋势，且仅在P3～P4阶段经历长时间（3～5d）的持续低温处理后成苗率显著降低，这可能是由于长期低温处理导致植物体内能量的亏缺导致植株的死亡[20]，同时张海艳[21]研究发现植株地上部比地下部对温度响应更为敏感，严重抑制了破土至出苗临界期玉米胚根和胚芽的快速生长，甚至导致植株生长停滞和死亡。此外，随着玉米幼苗生育进程的推进，尽管P5和P6阶段耐冷性有所提高，但在长时间持续低温条件下成苗率也会有小幅度下降的趋势。

表3 不同阶段低温、低温持续天数对玉米幼苗光合作用与抗性生理特性的交互效应Table 3 Interactive effects of low temperature treatment phases and durations on characteristics of maize seedling leaf photosynthesis and physiological indexes for resistance

图5 不同阶段低温处理及低温持续时间条件下叶片抗性生理指标的变化Fig.5 Changes of leaf physiological indexes for resistance effected by low temperature with different phases and various durations

已有研究表明，低温胁迫后玉米幼苗生长将受到明显抑制，初生胚根长、株高、茎基部直径、地上部鲜重、根系鲜重及叶面积出现明显的下降趋势[22]，胚芽鞘的相对生长率也显著高于正常生长植株[23]。本研究结果表明，播后各阶段随着低温处理时间的延迟，玉米幼苗的株高、茎基部直径、叶面积、初生胚根长、生物量积累呈逐渐降低趋势，相对而言，以P3～P6阶段受低温处理的影响较为明显；尽管胚芽鞘长随低温持续时间的增加呈逐渐增长趋势，但仅在P3D5、P4D3、P4D4和P4D5处理组合下影响达显著水平。刘禹辰等[24]认为种子萌发的过程是淀粉等贮藏物质水解为小分子物质的过程，水通过促进种子吸胀，引起种子内各种酶活性增强，降解种子贮藏物质，促进种子萌发。本研究中，相比于对照处理，P2和P3阶段4～5d、P4阶段2～5d、P5阶段3～5d和P6阶段5d的低温处理明显抑制了贮藏物质转运率，这可能是持续低温影响种子呼吸代谢途径及幼苗碳源与能量供应的结果[25]。

植物细胞中可溶性蛋白、脯氨酸以及可溶性糖是重要的渗透调节物质，对维持细胞膨压、缓解低温胁迫对细胞造成的损伤具有重要作用[26]，而丙二醛是植物在逆境胁迫下膜脂过氧化的分解产物，其含量的高低可以有效反映细胞受伤害的程度[27]。Hendrickson等[28]和田礼欣等[29]研究发现，低温胁迫可降低光合色素的合成速率，加速叶绿素的降解，引起膜脂过氧化，抑制光能的吸收与传递，最终致使光合速率降低。本试验条件下，随低温持续时间的延长，幼苗叶片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸与丙二醛含量在各阶段均呈增加趋势，而SPAD值和Fv/Fm逐渐降低；随着低温处理阶段的延后，渗透调节物质与丙二醛含量呈先增加后下降的趋势，而SPAD值和Fv/Fm呈先降低后升高趋势，分别在P4阶段达极值，这进一步说明，尽管播种后至苗期各阶段的低温处理均会引起幼苗光合作用效率及抗性生理特征的响应，但这种低温胁迫的影响程度因低温处理时期的不同而有所差异，以P3～P5阶段受到影响较为明显，特别是长时间持续低温将对植株造成一系列不可逆的生理损伤，从而引起成苗率的显著下降。

4 结论

播种后至苗期不同阶段的低温胁迫，可不同程度地延长玉米出苗时间，降低成苗率，抑制玉米幼苗的生长及生物量积累，引起玉米幼苗叶片SPAD值和Fv/Fm的降低，进而引进渗透调节物质含量的增加与膜脂过氧化程度的加剧，促使幼苗素质降低，弱苗比例增加，难以构建高产群体；这些不利影响的程度随低温持续时间的延长而不断加剧，且以播种后11～25d，特别是16～20d，即处于破土至出苗临界期的玉米植株对低温胁迫最为敏感。