基于CoMFA研究培氟沙星均三唑硫醚衍生物抗增殖活性与分子设计

冯 惠，秦正龙，李 靖，冯长君

(1. 徐州工程学院材料与化学工程学院，中国 徐州 221018；2.江苏师范大学化学与材料科学学院，中国 徐州 221116)

因拓扑异构酶既是抗菌作用靶标，也是抗肿瘤药物的重要靶点，由此可通过结构修饰将以喹啉-4-酮-3-羧酸为优势药效团的氟喹诺酮药物的抗菌活性转化为抗肿瘤活性[1,2]。值得关注的是DNA拓扑异构酶Ⅱ(Topo II)可能是一些杂环缩氨基硫脲类化合物的抗肿瘤作用靶点，而该靶点也是抗肿瘤药物研究的重要靶点[3]。胡国强等[4,5]发现氟喹诺酮中C-3羧基并非是抗肿瘤活性所必要的药效团，被其等排体如酰腙、唑杂环等替代可提高其抗肿瘤活性。因此，谢玉锁等[6]利用药效团拼合原理，用均三唑杂环作为抗菌培氟沙星(Pefloxacin)C-3羧基的等排体，并引入缩氨基硫脲，成功合成24个培氟沙星均三唑硫醚衍生物。他们采用MTT法测定上述化合物对小鼠白血病细胞(L1210)的体外抗增殖活性(IC50)，其半数抑制浓度明显低于前体药培氟沙星。冯惠等[7]采用半经验计算法 MOPAC-AM1研究15种氟喹诺酮均三唑稠杂环类衍生物( FQTHs)体外抗肿瘤活性，获得良好的拟合性。赵晓辉等[8]釆用 Sybyl-X 2.0软件中的比较分子力场分析(CoMFA)、比较分子相似性指数分析(CoMSIA)方法研究12种氟喹诺酮(FQs)同系物光降解半衰期(t1/2)，预测能力令人满意。目前尚未见到有关培氟沙星(Pefloxacin)同系物的定量结构-活性相关(Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)研究[9-12]的报道。

徐光宪曾称定量结构-活性相关为21世纪化学的4个“世纪难题”之一，因它涉及化学的根本问题。QSAR是基于数理及统计方法研究分子结构与性能之间定量关系的学科，已在预测化合物理化性质与生物活性方面成为化学、医药、环境等学科的热门领域。目前，QSAR主要分为二维(2D)和三维(3D)两类[13]。后者由于引入分子结构的三维构象信息，通常能够获得质量更佳的QSAR模型。在3D-QSAR方法中最为常用的是1988年Crameretal提出的比较分子力场分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)[14-21]。本文基于CoMFA方法建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞(L1210)体外抗增殖活性(pIC)[6]的3D-QSAR模型，以揭示影响pIC的分子结构因素，探讨抑制小鼠白血病细胞(L1210)作用的微观机理。

1 数据来源

24种培氟沙星均三唑硫醚衍生物的分子基本结构[6]见图1，其中取代基R和X见表1。在表1中的“IC50”是上述化合物对小鼠白血病细胞(L1210)的半数抑制浓度，其单位为μmol·L-1。

根据化学平衡理论，化学反应自由能变(ΔG)与体系平衡浓度为对数关系。故令：

pIC= -lg[IC50/(mol·L-1)]。

(1)

它们的pIC数据见表1。

2 建模方法

培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞体外抗增殖活性[6]的3D-QSAR模型，采用Tripos公司Sybyl-x2.1.1药物分子模拟软件予以建立。

2.1 化合物分子药效构象的确定及分子叠合

使用Sketch molecule模块构建24个培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子[6]和新设计3个分子的初始三维结构；对上述分子进行分子力学能量优化的程序为Minimize模块，以获得它们能量最低构象，即药效构象(亦称生物活性构象)，用于分子叠合。

图2 训练集(a)、测试集(b)的叠合图 Fig. 2 The plots of all the aligned molecules in training set(a) and test set(b)

随机抽取第3，9，16，22及23号分子以及新设计的3个分子(25～27号分子)为测试集(Test set)，余下20个分子作为训练集(Training set)。在Align database中采用原子契合的公共骨架叠合方式，其公共骨架为样本中生物活性最强的分子(即模板分子)所提供。该叠合方式能够尽量使分子间相互重叠时取向相同，叠合误差最小。Align database模块以对L1210细胞体外抗增殖活性最强的22号分子提供叠合的公共骨架，Align database模块给出的训练集、测试集叠合图见图2，图中显示各个分子间密切叠合。

表1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子结构与抗增殖活性(pIC)

2.2 CoMFA模型的建立

采用CoMFA计算训练集中每个叠合分子周围所有网格点上的立体场(Steric，St)及静电场(Electrostatic，El)的场能值。以对小鼠白血病细胞(L1210)体外抗增殖活性pIC为因变量，场能值为自变量，用偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)进行建模。一是以交叉验证系数Rcv2衡量模型的预测能力，要求模型Rcv2>0.5，其可信度优于95%，统计意义十分显著[22]；二是进行回归分析，即以最佳主成分数N建立非交叉QSAR模型，获得相关系数R2、统计方差比F、估计标准误差SD；最后通过View CoMFA模块呈现三维等势图，以直观反映立体场和静电场对培氟沙星均三唑硫醚衍生物pIC的贡献。

3 结果与讨论

3.1 pIC的CoMFA模型

培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞(L1210)体外抗增殖活性pIC的3D-QSAR模型见表2。

表2 训练集pIC的CoMFA模型

模型质量检验如下：

(1)交叉验证部分：Rcv2>0.5，表明模型的或然性很低，具有良好的预测能力与稳健性。

(2)非交叉验证部分：①判定系数检验：具有良好拟合性的QSAR模型，其R2≥0.80[23]。R2=0.926>0.8，显示良好的相关性。由于判定系数R2又称为削减误差比例，说明该模型包含了影响pIC的92.6%以上因素，未被揭示的因素所占份额不足7.4%，因此可用于pIC的估算与预测。②显著性检验：在95%显著水平下，训练集CoMFA模型的F临界值为：F0.05(4,15) =3.06。所建模型的F是其15倍之多，表明模型规定的因果关系显著，有95%以上的可信度。

(3)外部预测能力：利用训练集的3D-QSAR模型对测试集中分子的pIC进行预测，以检验其外部预测能力。由表1可见，对pIC预测的平均绝对预测误差仅为0.139，与相应实验值非常吻合，显示很好的外部预测能力。

3.2 CoMFA等势图

CoMFA模型的三维等势图分为立体作用分布图和静电作用分布图。

图3 CoMFA模型的立体场(a)与静电场(b)等势图Fig. 3 CoMFA contour maps (a) steric field; (b) electrostatic field

以化合物22为模板分子的pIC的三维立体场等势图见图3(a)(彩图见封三)。在缩氨基硫脲部位有2个绿色区域，该区域引入体积较大的取代基有助于提高化合物的抗增殖活性。因此，1～12号化合物没有缩氨基硫脲部分，其抗增殖活性都弱于相应13～24化合物。另外，在苯环的3,4-位之间(偏4-位)有个黄色区域，该区域引入体积小的基团会使化合物的生物活性增强。例如6和18号化合物的3,4-位基团为—OCH2—，7和19号化合物的3,4-位为MeO—，它们的体积均比2～5及14～17号化合物的取代基大，因此，化合物6，7，18及19的抗增殖活性较弱。

以化合物22为模板分子的pIC的三维静电场等势图见图3(b)。在缩氨基硫脲部位有个靠近氨基中氢原子较大的蓝色区域，在此区域引入正电性基团利于生物活性增强。后12个化合物具有缩氨基硫脲，因此，它们的抗增殖活性都强于(相应)前12个化合物。在苯环的4-位有个红色区域(忽略较远处的一个小红色区域)，此区域引入负电性取代基有助于增强化合物的抗增殖活性。例如4-位上氟原子是最强的负电性基团，故10号在前12个化合物中、22号在后12个化合物均有最强的抗增殖活性。尚需指出，12号和24号化合物中苯环的4-位为硝基(—NO2)，虽然—NO2中存在2个电负性仅次于氟原子的氧原子，但其抗增殖活性均为前12和后12中最弱(4.246与4.629)。因这2个负电性氧原子均部分处于红色区域，而正电性的氮原子(其电负性低于氧原子)却处于红色区域，导致抗增殖活性急剧下降。

表2给出立体场和静电场对pIC的贡献分别为72.8%和27.2%，显示取代基的立体作用2.6倍于静电作用。立体场通常含有疏水作用和空间位阻，库仑力、氢键及配位归于静电场。因此，影响pIC主要取决于取代基的疏水作用和空间位阻，其次是与靶标形成库仑力、氢键及配位作用。

3.3 分子设计

由3.2分析可知，在苯环的4-位上引入小体积的负电性基团，能够增加培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞(L1210)体外抗增殖活性pIC。据此设计3个化合物(见表1中第25～27号化合物)，CoMFA模型给出的pIC预测值为5.224～5.332，均优于22号分子预测值(5.130)。

4 结论

(1)基于CoMFA建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞(L1210)体外抗增殖活性的3D-QSAR模型：Rcv2=0.659，R2=0.926，F=47.21，显示优良的鲁棒性、拟合性和预测能力。

(2)CoMFA模型的立体场和静电场对pIC的贡献分别为72.8%和27.2%，显示立体作用近3倍于静电作用。

(3) CoMFA模型三维等势图显示在苯环的4-位上引入小体积的负电性基团，使培氟沙星均三唑硫醚衍生物对小鼠白血病细胞(L1210)的体外抗增殖活性增强。据此设计的3个化合物，显示较大的pIC预测值，有待生物医学实验确认。