类芽胞杆菌(Paenibacillus)对植物促生御病机理研究进展

于文清，肖俊杰，刘文志, *，闫凤超，郑桂萍

(1.上饶师范学院生命科学学院 上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001；2.黑龙江省农垦科学院，黑龙江 哈尔滨 150038；3.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319)

类芽胞杆菌属(Paenibacillus)归类于厚壁菌门(Firmicutes)类芽胞杆菌科(Paenibacillaceae)，1993年从芽胞杆菌属(Bacillus)中分出来，建立了类芽胞杆菌属，这一属名来源于拉丁语“paene”，意为几乎是芽胞杆菌(Bacillus)[1]，多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是其模式种[2]。类芽胞杆菌在自然界分布广泛，与动物、植物、人类及环境关系密切，在医药、工业、环境、农业等领域有重要的应用价值[3-4]。国际上对其产木聚糖酶[5-6]、抗菌[7-8]及诱导植物抗性或免疫活性[9-10]，固氮、溶解有机磷、耐受重金属[11-12]、产生植物激素、吲哚及酚类物质[13]、促进植物生长[14]，染料脱色等都有研究[15]。我国对类芽胞杆菌功能的研究主要集中在抗菌[16-18]、产木聚糖酶[19]、固氮[20]、产胞外多糖[21]、产碱性果胶酶[22]、产絮凝剂[23]等方面，研究涉及多粘类芽胞杆菌、固氮类芽胞杆菌(P.azotofixans)、克里本类芽胞杆菌(P.kribbensis)、埃吉类芽胞杆菌(P.elgii)、土壤类芽胞杆菌(P.edaphicus)等[24-26]。其中，多粘类芽胞杆菌对作物病害防治的研究最深入。多粘类芽胞杆菌能防治多种植物病原细菌、病原真菌、根结线虫等有害微生物，作用机制多种多样。类芽胞杆菌多栖息于土壤中，具有向植物根定向移动并定殖的能力[10]，并对植物产生有益作用[27-28]，农业生产中可补偿或替代化学肥料与化学农药的应用。本文拟从细菌自身代谢特性出发，梳理类芽胞杆菌对植物促生及御病机理研究现状，并对未来研究发展的趋势进行展望，为在可持续农业中的应用研究提供参考。

1 类芽胞杆菌对植物的促生机制

类芽胞杆菌能够通过各种途径促进植物生长，其中包括溶解有机磷或无机磷，释放矿物钾和硅、固定空气中的氮及产生铁载体等[14，29]。

1.1 通过固氮为植物提供氮素营养

类芽胞杆菌中至少有20个种具有固氮能力[12]和为植物提供氮素营养的潜力[30]。在玉米根际发现的P.brasilensis及P.maysiensis[31-32]，小麦根际发现的P.zanthoxyli及P.rhizophilus[33-34]，在灌木根际发现的P.sabinae[35]均具有固氮能力。固氮酶是生物固氮所必需的，对固氮酶基因的鉴定及活性检测是研究生物固氮功能快速而有效的方法，如Seldin[36]在对具有固氮功能的类芽胞杆菌的研究中，用nif探针对分离自不同类型土壤中的菌株的固氮功能进行了研究，表明在供试的16株菌株中检测到的nif基因簇在这些种间是高度保守的。

一项针对类芽胞杆菌属的15株具有固氮功能菌株的研究表明，在这些菌株的基因组中，存在9个nif基因，包括nifB、nifH、nifD、nifK、nifE、nifN、nifX、hesA和nifV，分子质量为10.5～12 kb。除了依赖于钼(Mo)的固氮酶(Nifs)外，还发现了不含Mo辅因子，但含钒和铁(Vnf)或仅含铁(Anf)的固氮酶[37]。除nifs外，在P.zanthoxyliJH29 和固氮类芽胞杆菌ATCC 35681的基因组中，存在固氮酶Vnf的编码基因，而P.sophoraeS27、P.forsythiaT98和P.riograndensisSBR5T则编码Anf。Vnf或Anf可以在某些逆境如缺钼条件下表达[38]；两个不同的研究分别发现Paenibacillussp. WLY78[39]与多粘类芽胞杆菌CR1[37，40]均含有上述15个菌株携带的Nif基因簇，并发现了一个HesA编码基因。土地类芽胞杆菌(P.terrae) NK3-4基因组中除了nifs外，还携带了hesA及hesB/hesB-like[41]。HesA又称NAD/FAD结合蛋白或硫胺素生物合成蛋白，是ThiFMoeB-HesA家族成员，与钼喋呤硫胺素生物合成有关[42-43]，它和HesB均与固氮酶的成熟相关，HesA和HesB是类芽胞杆菌高固氮活性所必需的物质，只有在没有化合态氮的情况下才能表达[33，39，44]。 最新研究发现，多粘类芽胞杆菌WLY78 HesA突变株在高钼酸盐或胱氨酸条件下几乎丧失固氮能力，认为HesA是一种新的必需的固氮酶基因，与S和Mo引入Mo-Fe固氮酶有关[45]。

1.2 将不溶性磷转化为可溶性磷为植物提供磷素营养

溶磷微生物通过各种机制溶解不可利用性磷，其中最重要的是有机酸酸解(尤其是分泌葡萄糖酸)，此外还包括酶解(磷酸酶/植酸酶、脱氢酶、核酸酶)及直接氧化作用[46]。类芽胞杆菌代谢过程中分泌的有机酸可通过阴离子交换、螯合态金属离子或降低土壤pH值将磷从矿物复合体中释放出来。一项针对35个类芽胞杆菌的基因分析表明，多数具溶磷功能的类芽胞杆菌均含有与葡萄糖酸代谢相关的基因，几乎所有菌株中都含有葡萄糖-1-脱氢酶基因和葡萄糖酸脱氢酶基因，且全部供试菌株均含有高度稳定的C-P键和磷酸盐特异性运输系统[47]，已经确认具有溶磷功能的种有埃吉类芽胞杆菌[48]、克里本类芽胞杆菌[49]、浸麻类芽胞杆菌(P.macerans)、多粘类芽胞杆菌[50]、胶冻样类芽胞杆菌(P.mucilaginosus)[51]、解木聚糖类芽胞杆菌(P.xylanilyticus)[52]和土地类芽胞杆菌[53]等，还有研究表明，供试的4株多粘类芽胞杆菌基因组中均含有溶磷基因(gcd)、磷酸盐载体及多个磷酸酯基因簇(phns)，包括nphA、nphB、nphC、nphD、nphE、nphX，其中有两株菌株除了phns外，还检测到了nphW、ppd、pepM[40]。

1.3 产生吲哚乙酸刺激植物生长

吲哚乙酸(IAA)能够调节基因表达、生长发育、参与细胞分裂、伸长、果实发育和衰老。在多种生长素中，IAA在自然界中含量最多，也最先被人们认识。植物除了自身能够合成植物激素外，还可以利用其他生物产生的外源激素[54]。产生IAA是类芽胞杆菌促进植物生长的机制之一[55]。吲哚-3-丙酮酸脱羧酶(IPDC)由丙酮酸脱羧酶基因(ipdC)编码，是多粘类芽胞杆菌E681 IAA代谢的关键酶[56]，在其他多粘类芽胞杆菌基因组中也鉴定到了ipdC，同时还鉴定出了3个IAA流出载体基因[40]。多粘类芽胞杆菌CF05可通过分泌IAA促进番茄的生长[57]。除多粘类芽胞杆菌外，Paenibacillusqinlingensis[58]和P.riograndensis[59]也产生IAA。

1.4 产生铁载体将铁元素转化成植物可吸收状态

分泌铁载体、活化矿物钾也是类芽胞杆菌促生的机制之一，但相关的研究有限。研究涉及的多粘类芽胞杆菌[60]、P.sinopodophylli[61]、短小类芽胞杆菌(P.panacihumi)[62]和P.riograndensis[59]的类芽胞能够产生铁载体，将铁元素转化成植物可吸收状态，具有促生功能。

2 类芽胞杆菌对植物的御病机理

类芽胞杆菌可防御多种植物病害，对花椰菜黑腐病[63]、豌豆根腐病[64]、人参根腐病、黄瓜霉腐病[65]、鹰嘴豆根腐病[66]、花生茎腐病[67]、大豆褐腐病[68]、水稻稻瘟病[69]、番茄枯萎病[70]、番茄灰霉病[71]、西瓜枯萎病[72]和西红花种球腐烂病[73]等植物病害均具有显著的防治效果。其中多粘类芽胞杆菌在植物病害防治方面的应用潜力得到了人们极大地认可，可开发成生物农药[74]，其他具有生物防治功能的类芽胞杆菌包括蜂房类芽胞杆菌(P.alvei)[75]、P.brasilensis[76]、P.dendritiformis[77]、P.ehimensis[78]、柯本氏类芽胞杆菌(P.kobensis)[79]、P.lentimorbus[80]、浸麻类芽胞杆菌、皮尔瑞俄类芽胞杆菌(P.peoriae)[81]、解硫胺素类芽胞杆菌(P.thiaminolyticus)[82]和土地类芽胞杆菌[69]等。类芽胞杆菌多在土壤中发现，通常栖息在植物根周，与植物关系密切，因此能够适应土壤环境，也更倾向于环境友好。除了植物根周，类芽胞杆菌还以植物内生菌的形式存活于植物组织内部，并与植物发生互作[83]。诱导抗性及产生多种抗菌活性物质保护植物是类芽胞杆菌防治植物病害的两种重要机制。

2.1 通过诱导植物抗病性防御植物病害

在与植物互作的过程中，多数类芽胞杆菌可诱导植物抗性，包括对致病细菌、真菌、线虫及病毒的系统防御及系统抗性[84]。如多粘类芽胞杆菌KNUC265可通过产生挥发性有机化合物(VOC)作为激发子，防御地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)和欧文氏菌(Erwiniacarotovora)侵染辣椒和烟草[85]；多粘类芽胞杆菌E681可产生挥发性有机化合物激发子，诱导水杨酸、茉莉酸和乙烯信号传导基因的表达，以保护拟南芥(Arabidopsisthaliana)不受丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaei)侵染[86]，蜂房类芽胞杆菌可诱导拟南芥对大丽轮枝菌的抗性[75]；克里本类芽胞杆菌可诱导水稻对纹枯病的系统抗性[87]；埃吉类芽胞杆菌MM-B22通过产生防御酶和H2O2诱导的细胞死亡使黄瓜对黄瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare)产生抗性[84]。对植物RNA基因的研究表明，多粘类芽胞杆菌可诱导植物抗逆基因ERD15的表达[88]。

2.2 通过产生抗菌活性物质抑制植物病原菌

类芽胞杆菌中，相当一部分类芽胞杆菌均可产生抗菌物质，而且同一类芽胞杆菌的不同菌株之间产生的抗菌活性物质也是多种多样的[89]。类芽胞杆菌的抗菌特性多因其产生多肽类抗生素，包括八肽菌素(octapeptin)[90]、gavaserin、saltavalin[91]、乔利肽菌素(jolipeptin)、片球菌素(pediocin)[92]、圈杆菌素(Polypeptin )[93]、杆菌霉素(Bacillomycin)、表面素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、subtilosin A、丰原素(fengycins)/制磷脂菌素(plipastatins/agrastatins)[94]、pelgipetin[95]、tridecaptin B1[96-97]、paenicidin[98]、penisin[99]、paenibacillin[100]、多粘菌素(polymyxin)[101-102]、短杆菌肽(gramicidin)[103-104]、bacillopeptin[105]及杀镰孢菌素(fusaricidin)[106]。仅多粘类芽胞杆菌就能产生多种脂肽类如多粘菌素、粘菌素、环杆菌素、乔利肽菌素、多肽菌素、谷缬菌素、杀镰孢菌素等，蛋白质类如核苷、吡嗪和酚等多种具有抗菌活性的物质，并在防治多种植物病害中发挥着重要作用[8，107]。类芽胞杆菌还可产生细菌素(rSAM/SkfB)[108-109]；蛋白酶类，如枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、霉菌膜素(mycosin)；糖基水解酶类，如几丁质酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等。

1株从海泥中分离的多粘类芽胞杆菌L1-9菌株对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、棉花黄枯萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)、苹果斑点落叶病菌(Alternariaalternata)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers)、番茄早疫菌(Alternariasolani)等病原菌均具有抑制作用，从该菌株的发酵液中分离到分子量约为31 kDa的非酶类抗菌蛋白[18，110-111]；陈海英等[112]研究发现多粘类芽胞杆菌CP7菌株分泌的抗菌物质对荔枝霜疫霉菌等真菌具有很强的抑制作用，其作用机制为荔枝霜疫霉菌形态发生变化，菌体细胞组织结构受损，细胞器消溶，孢子囊畸形、外壁受损，孢子囊内细胞器溶解、物质大量外泄，细胞呼吸速率和NADH 氧化酶活力受到抑制。P.ehimensisKWN38的粗酶提取物可导致植物病原菌禾谷镰孢菌，尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和辣椒疫霉菌丝变形并抑制其生长[78]，这些作用机制都与其产酶活性相关。可见，产生糖基水解酶、蛋白酶、挥发性有机化合物、细菌素、非核糖体脂肽等是类芽胞杆菌发挥抗菌功能的重要机制。

糖基水解酶类：β-1, 3-葡聚糖和几丁质是丝状真菌细胞壁的主要成分，卵菌细胞壁的主要成分为β-1, 3-葡聚糖、β-1, 6-葡聚糖和纤维素。类芽胞杆菌的水解酶可以攻击真菌和卵菌细胞壁，多种栖息在土壤中的类芽胞杆菌均能产生葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶，这些酶类能够破坏真核生物细胞壁。如土地类芽胞杆菌(P.terrae) NK3-4能够产生具有抗真菌活性的β-1, 3-葡聚糖酶[113]，类芽胞杆菌P.ehimensisIB-X、P.ehimensisMA2012和多粘类芽胞杆菌 A21产生的葡聚糖酶和几丁质酶能够损伤细胞壁结构或抑制立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、瓜果腐霉(Pyhaniumaphanidermatum)、交链链格孢菌(A.alternata)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和麦类根腐德氏霉(Drechlerasorokiniana)等病原菌[114-117]，Paenibacillussp. D1能够产生稳定性较强的几丁质酶，这暗示水解酶类具有补充和替代化学杀菌剂的潜力[118]。还有一些能够产生木聚糖酶的类芽胞杆菌，主要包括巴塞罗那类芽胞杆菌(P.barcinonensis)、坎皮纳斯类芽胞杆菌(P.campinasensis)、P.curdlanoluticus、P.favisporus、浸麻类芽胞杆菌、马阔里类芽胞杆菌(P.macquariensis)、P.nanensis、饲料类芽胞杆菌(P.pabuli)、叶际类芽胞杆菌(P.phyllosphaerae)、P.septentrio、土地类芽胞杆菌、泰国槟榔类芽胞杆菌(P.thailandensis)、P.woosongensis和多粘类芽胞杆菌等[5-6，119-123]。类芽胞杆菌糖基水解酶多用于食品、工业和制造业，防治作物病害的应用较少，但这类微生物因其糖基水解酶活性在作物病害生物防治方面的潜在优势，其应用也越来越受到关注。

挥发性有机化合物： 挥发性有机化合物(VOCs)因可通过土壤孔隙中的空气扩散至相对较远的范围，从而增强了土壤微生物之间的互作[124]。类芽胞杆菌属物种能够产生大量的VOCs[125]。例如，多粘类芽胞杆菌 WR-2能够产生42种VOCs，有30多种对尖孢镰刀菌具有不同程度的抑制作用，其中13种能完全够抑制其生长。这些化合物包括苯、醛、酮和醇，还有一些产量较低的物质，如苯并噻唑、苯甲醛、十一醛、十二烷醛、十六烷醛、2-十三烷酮和苯酚为主的抗真菌化合物[126]。此外，一些VOCs，如埃吉类芽胞杆菌HOA73产生的2, 3-二羟基苯甲酸甲酯，对灰葡萄孢菌、尖孢镰孢菌、辣椒疫霉菌和番茄早疫菌均有抑制作用[127]。

核糖体肽——细菌素：细菌素是核糖体合成的蛋白质毒素，可抑制细菌的生长。类芽胞杆菌属能产生3类细菌素中的至少两种，包括羊毛硫抗生素(Lantibiotics)和片球菌素。羊毛硫抗生素也被称为I类细菌素，含有非编码氨基酸羊毛硫氨酸[128]。羊毛硫抗生素通常在细菌生长的指数后期或稳定期前期产生，并经过翻译后修饰产生活性[129]。近些年，人们发现了类芽胞杆菌中的羊毛硫抗生素，如He等[130]于2007年首次报道的paenibacillin，多粘类芽胞杆菌OSY-DF的前体肽是由一个含有羊毛硫抗生素脱氢酶、环化酶、肽酶及ABC转运蛋白的基因簇编码的[107]。其他羊毛硫抗生素如penisin由类芽胞杆菌菌株A3 产生[99]。与羊毛硫抗生素相比，片球菌素作为II类细菌素，在类芽胞杆菌中较少被发现，但在多粘类芽胞杆菌中发现了片球菌素SRCAM 37和SRCAM602[92]。

非核糖体脂肽：与细菌素相反，许多由类芽胞杆菌产生的抗菌肽并非由核糖体合成，不依赖RNA，而是在非核糖体肽合成酶(NRPS)的组装线上生成的。类芽胞杆菌属产生的非核糖体脂肽，包括saltavalin、乔利肽菌素和十三肽[96]。根据脂肽的性质，可将其分为阳离子环脂肽和非阳离子环脂肽。

阳离子环脂肽：研究最彻底的类芽胞杆菌属来源的阳离子环脂肽是多粘菌素。多粘菌素是最先从多粘类芽胞杆菌中分离出来的，后来在蜂房类芽胞杆菌、柯本氏类芽胞杆菌和类芽胞杆菌的其他物种中也发现了这一脂肽类抗生素[79，99]，属于一个肽家族，成员包括多粘菌素A、B、C、D、E(也称粘菌素)、M(也称Mattacin)、P、S和T[98-100]。迄今发现的多粘菌素基因簇，均编码三个NRPSs和两个ABC转运蛋白[131]。

非阳离子环脂肽：杀镰孢菌素对真菌和各种革兰阳性菌具有拮抗活性，多粘类芽胞杆菌KT-8产生的杀镰孢菌素是最先在类芽胞杆菌中发现的环状非阳离子脂肽[105]，是一类多肽环，含有一个酰胺键及一个或多个酯键(缩肽)，连接一个胍基化的β-羟基脂肪酸[106，132]。Beatty等[8]通过对稀有植物芸苔根际分离到的多粘类芽胞杆菌对黑胫病菌(Leptosphaeriamaculans)的抑制作用的研究表明，在马铃薯葡萄糖培养基上培养至芽胞形成期是抗菌肽产生的最佳时期，通过甲醇提取，排阻反相色谱法纯化及Edman降解法和大通量光谱法进行序列分析，明确了具有抗菌活性的物质是肽的混合物，分子量分别为883、897、948 和 961 Da，其中分子量为897 Da的肽含有环脂肽类(杀镰孢菌素)基团。

3 组学技术的应用

组学技术的快速进步，促进了类芽胞杆菌基因组的研究，从而不断的揭示其对作物病害防治的机理。基因组测序技术的应用，可以帮助发现更多新的活性物质。截至2020年1月20日，NCBI公开了149个基因组信息，包括类芽胞杆菌JDR-2[133]、多粘类芽胞杆菌E681[134]、SC2[135]、CCI-25[136]及NRRL B-30644[137]等具有应用潜力的菌株。多粘类芽胞杆菌E681的研究最为深入，对该菌株的研究从2006年开始到2018年之间，共发表了10余篇研究论文，较为系统地研究了其生防机制。该菌株首先被用于芝麻种子包衣，通过包衣提高其生防功能[138]，其蛋白质组也进行了研究和分析，进一步揭示了其对作物病害的防治机制是在植物的诱导下产生生防物质[139]，并发现合成杀镰刀菌素是其抗菌机制之一[140]，同时该菌株产生的杀镰刀菌素也可诱导辣椒对枯萎病的系统抗性[141]。此外产生挥发性有机物也是其诱导植物抗病性的机制之一[86]，基于基因组数据[134]，鉴定了该菌株产生的新的羊毛硫抗生素paenilan的生物合成基因簇，对其合成产物进行了解析[142]，并结合质谱与基因组信息，挖掘合成新抗生素基因，用于合成paenilipoheptin[143]。此外对E681菌株促生机制也开展了研究，外源表达并研究了其吲哚-3-丙酮酸脱羧酶功能[56]，同时还分离出该菌株转座子突变体，改变了IAA的生物合成，为进一步研究该菌株可通过产生IAA促植物生长的特性及其作用机制提供了阴性对照材料[144]。

组学技术的发展，为类芽胞杆菌对作物病害防治机制的研究提供了新的思路，将基因组学、转录组学、蛋白质组学乃至代谢组学技术贯穿融合，揭示类芽胞杆菌与病原菌互作、类芽胞杆菌与植物互作及三者之间互作机制，是当前研究的新思路及热点，可为系统研究类芽胞杆菌促生御病机制提供技术支撑。

4 展 望

类芽胞杆菌属建立以来，至少有222个种的300余株菌株的16S rDNA序列在NCBI GeneBank中公开发表，其中有一半菌株进行了基因组测序，可见人们对这一类群的极大兴趣，也反映了类芽胞杆菌的价值。这些可公开获取的基因组信息也为其功能基因的挖掘与系统研究奠定了基础。随着类芽胞杆菌在农业上的应用价值得到认可，其促生及御病机理也必将受到越来越多地关注，吸引更多的研究者。今后的研究方向：在不断发现新种及具有应用价值的新菌株的同时，继续对其功能基因及代谢产物进行挖掘与应用，进一步揭示其复杂多样的作用机制。目前对类芽胞杆菌促生御病的研究，除了多粘类芽胞杆菌E681外，绝大多数研究还缺乏持续性和系统性。将类芽胞杆菌代谢特性与植物免疫学理论相结合，探索与植物间的相互作用过程中的信号识别、基因表达调控、信号转导、代谢调控等的机制，是系统研究类芽胞杆菌促生御病机制的通用思路，具有重要的参考价值。从生物与生物互作及生物与无机环境互作的角度看，类芽胞杆菌对植物促生及御病的机制，在植物不同生长发育阶段、不同植物种类、不同环境条件，甚至是不同生物胁迫之间，必定存在差异，因此，从上述角度出发研究其作用机制，对其应用研究会产生更为重要的指导意义，应得到相关研究者的重视。