病证结合制备冷哮型哮喘模型大鼠的研究

赵 晔，柴茂山*，范 戈

(1.山西大同大学中医药健康服务学院，山西大同 037009；2.万荣县中医医院，山西万荣 044200)

据统计全球72 亿人口当中，约每20 人中就有1例哮喘患者，总计约3 亿多人。在中国，据估计哮喘患者可达2 000 万以上。现代医学在治疗哮喘的过程中患者病情常反复发作，如不能加以及时有效控制，会严重影响患者的生活、学习及工作，甚者导致死亡。

中医认为哮喘的病机主要是因痰饮之邪凝聚而无以温化，终成夙根，伏藏于肺，再加之外邪的引动，而发为哮喘。哮喘与肺脾肾三脏关系密切，而痰饮伏藏则作为哮喘反复发作的主要内因。《证治汇补》中较为明确地阐述了哮喘发病的病因病机，认为因胸中气之壅塞，膈间又有顽痰之胶着，再有外寒之侵袭，导致气道不畅，发为哮喘。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组

实验动物：由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的8 周龄SPF 级健康雄性SD 大鼠60 只，体质量180 ± 20 g，合格证编号为SCXK（京）2018-0016。实验前期在清洁级动物饲养室适应性饲养1周，之后随机分作正常对照组、冷哮模型组、中药干预组，每组20只。

1.2 药材和试剂

1.2.1 实验药材

所用中药饮片（麻黄、桂枝、半夏、白芍、干姜、细辛、五味子、炙甘草）皆由北京同仁堂饮片责任有限公司提供。前期研究中细辛为9g的小青龙汤疗效最好，因此复方中药物剂量为：麻黄9 g，桂枝6 g，芍药9 g，细辛9 g，干姜3 g，半夏9 g，五味子3 g，炙甘草6 g。换算大鼠的剂量：根据人和动物间按体表面积折算等效剂量，人的临床剂量为X g/kg，大鼠的等效剂量相当于人的6倍，即大鼠的剂量＝6X g/kg。中药干预组以剂量为4.8 g/kg，按药量为相对浓度煎液1 mL/100g 每日给大鼠灌服小青龙汤水煎剂；对照组灌服等体积蒸馏水。

1.2.2 实验试剂

美国Sigma 公司的卵白蛋白（OVA）干粉（批号：A6567）、浙江康乐药业有限公司的0.9%氯化钠注射液（批号：20180612）、天津金汇太亚化学试剂有限公司的氢氧化铝粉末（批号：CNAB038-S）。

1.2.3 实验仪器

瑞腾医疗器械股份有限公司的超声雾化器（402A型）；日本东芝公司的全自动血细胞分析仪；德国赛多利斯的BS224S 万分之一天平；大鼠雾化箱（60 cm ×50 cm×50 cm）；泳池（50 cm×40 cm×40 cm）。

2 实验方法

2.1 造模方法

将60只大鼠随机分作对照组、冷哮模型组[1-2]、中药干预组，每组20 只。将各组大鼠第3～4 胸椎前后左右1～2 cm 处毛发用脱毛剂去除，每日将冷哮模型组、中药干预组的大鼠在温度为0 ℃左右气候箱中进行时长20 min 外寒刺激，之后再放于冰水混合的泳池内冰泳15 min。此2 组每日喂食冰冻的食物及冰水。实验开始后分别于第1 天、第8 天、第15天，冷哮模型组和中药干预组大鼠分别于腰部和腹腔各取2点注射氢氧化铝和10%卵蛋白的混悬液，每处注射0.5 mL，总计2 mL；对照组大鼠注射生理盐水2 mL。以上过程总计3 周。从第4 周起诱发哮喘，方法：将冷哮模型组、中药干预组大鼠依次置于雾化箱内，进行雾化处理（用1%卵蛋白60 mL 雾化，流量为5 mL/min），1 次/d，30 min/次，总计3 周；正常组大鼠生理盐水雾化。

2.2 检测指标

一般体征：毛发色泽、口鼻分泌物、呼吸频率及方式、腹肌状况、肛温与背心部温度、四肢温度及活动变化等。

血气分析检测：最后一次灌胃12 h 后，用注射器（肝素钠反复冲洗）取大鼠左心室3 mL 血液，用血气分析仪检测动脉血P（O2）、P（CO2）。

病理检测：剪开胸腔剥取含部分气管、支气管的右肺组织，然后用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色。

2.3 数据统计处理

用SPSS17.0 统计软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 一般体征

对照组各项体征均正常。冷哮模型组：呼吸困难、呼吸频率增快、点头式呼吸、打喷嚏、咳嗽、喘促，口唇发绀、口鼻分泌物增多，抓挠鼻、耳部，毛发零乱且无光泽，四肢、肛温及背心温度均降低，少动、扎堆、站立不稳、腹部肌肉痉挛等。中药干预组：上述症状逐渐减轻，无扎堆，毛发有光泽，口鼻部较干燥、无分泌物，咳嗽、喘促、打喷嚏次数减少，口唇发绀好转，四肢、背心体温及肛温均恢复正常。

3.2 血气分析测定

与对照组相比，大鼠的动脉血P（O2）在冷哮模型组显著降低（P＜0.01），动脉血P（CO2）在冷哮模型组中显著升高（P＜0.01）。与冷哮模型组相比，大鼠的动脉血P（O2）在中药干预组中显著升高（P＜0.01），但略低于正常组，动脉血P（CO2）在中药干预组中显著降低(P＜0.01)，但略高于正常组。

表1 大鼠血气分析（n=15）

3.3 病理检测

图1 大鼠右肺组织病理切片

病理切片显示（图1）：对照见大鼠无异常改变。冷哮模型组主要表现为支气管及肺泡间隔炎性细胞浸润，其中支气管管壁上皮组织细脱落、黏膜增厚、黏膜皱襞突出、平滑肌增生、周围血管充血扩张，肺泡扩张、间质瘀血、囊肿形成、间隔离断等，终末气道表现为炎性浸润、水肿等。中药干预组较模型组好转，炎症细胞浸润减少，仅表现出气道、黏膜少量炎性细胞浸润，肺泡轻度扩张及轻度瘀血，而未表现出明显细胞脱落、增生及支气管管腔狭窄等。

4 讨论

《症因脉治·哮病》曰：“痰饮留伏，结成窠臼，潜伏于内，偶有七情之犯，饮食之伤，或外有时令之风寒，束其肌表，则哮喘之症作矣。”指出哮喘病因为内因痰饮久伏于肺、外则遇诱因或感邪引触。哮病有寒热之分，冷哮则最为常见。《灵枢·邪气藏府病形》中记载：“形寒寒饮则伤肺，以其两寒相感，中外皆伤，故气逆而上行。”指出“寒饮”“形寒”均可伤及肺阳，以至阳的温化水液功能失司，而致寒饮内停。《素问·咳论》曰：“皮毛者，肺之合也。皮毛先受邪气，邪气以从其合也。其寒饮食入于胃，从肺脉上至于肺则肺寒，肺寒则外内合邪，因而客之，则为肺咳。”指出寒饮入胃循经而损伤肺阳，又因“外邪”相引，以至肺阳更损肺之宣肃失常而见咳喘。由此可见肺咳可因寒饮入胃而引起。故在造模中，以低温环境及冰泳的方式造成“外寒”；以服食冰冻食物和饮用冰水造成内停之“寒饮”，终致大鼠肺阳耗损，寒饮之内停，加之外伤于寒邪，从而诱发冷哮。《痰饮咳嗽病脉证并治》曰：“水在肺，吐涎沫，欲饮水。”“夫心下有留饮，其人背寒如掌大。”故当水饮停肺时，则出现吐涎、背寒等症。

在研究关于细辛及小青龙汤的实验中，课题组不断完善冷哮型哮喘模型的建立途径与方法。通过文献查阅，在造模中借鉴其他课题研究中的有效方法，并对其改进，采用现代医学哮喘模型的建立方法与传统中医的病因病机相结合，尽可能地建立出契合临床中比较典型的冷哮病因症候模型。

从实验结果来看，模型组大鼠的症状与哮喘症候极为相似，亦与中医冷哮症候有所相同。血气分析检测显示：冷哮模型组与对照组相比，P（O2）在冷哮模型组降低显著（P＜0.01），P（CO2）在冷哮模型组升高显著（P＜0.01）；冷哮模型组与中药干预组相比，中药组P（O2）显著升高（P＜0.01），而P（CO2）明显降低（P＜0.01）。可见在造模过程中，大鼠出现组织缺氧和二氧化碳潴留，而中药干预组提高了哮喘模型大鼠通气功能，对冷哮有较好的改善作用。肺组织病理检测显示：冷哮模型组主要表现为支气管及肺泡间隔炎性细胞浸润，其中支气管管壁上皮组织细胞脱落、黏膜增厚、黏膜皱襞突出、平滑肌增生，周围血管充血扩张；其肺泡扩张、间质瘀血、囊肿形成、间隔离断等；终末气道表现为炎性浸润、水肿等。而经过中药干预之后，炎症细胞浸润减少，肺损伤有较好的缓解，仅表现出气道、黏膜少量炎性细胞浸润，肺泡轻度扩张及轻度瘀血，而未表现出明显细胞脱落、增生及支气管管腔狭窄等。以上均说明病证结合的方法可成功建立冷哮型大鼠模型，并且有很强的可靠性与可复制性。