浆液性卵巢癌中GPSM2的表达与化疗耐药及预后的相关性

张继方，吕庆杰

卵巢癌是恶性程度和病死率较高的妇科肿瘤，其中浆液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)是最常见的卵巢上皮性恶性肿瘤[1]。多数患者在疾病进展期时被发现，卵巢癌晚期患者的主要治疗方法为肿瘤细胞减灭术并辅以铂类和紫杉醇联合化疗[2]。在临床治疗中化疗耐药频繁发生。因此，寻找预测耐药的生物学标志物，对延长患者生存期具有重要价值。G蛋白信号调节蛋白2(G-protein signaling modulator 2, GPSM2)属于调节G蛋白激活的蛋白家族，通过调节纺锤体的定向运动维持细胞的对称性分裂。研究发现，GPSM2与恶性肿瘤关系密切，然而GPSM2在卵巢癌中的作用尚未有文献报道。本实验重点探讨GPSM2在SOC中的表达，并进一步分析GPSM2与化疗耐药及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料选取2012年1月～2014年12月中国医科大学附属盛京医院病理科存档的SOC石蜡标本131例以及同期浆液性囊腺瘤、交界性浆液性囊腺瘤、正常卵巢及输卵管石蜡标本各15例，该分组标准参考文献[3]。其中SOC患者年龄25～76岁，平均51.8岁，中位年龄51岁。按FIGO(2016)标准进行临床病理分期：Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期93例；肿瘤组织学分级：G1+G2级59例，G3级72例。另收集中国医科大学附属盛京医院行手术切除的新鲜SOC、正常卵巢、输卵管组织各10例。纳入标准：(1)均为原发性SOC患者；(2)均实施肿瘤细胞减灭术；(3)术前未接受放、化疗；(4)术后化疗方案为紫杉醇联合铂类治疗。根据NCCN指南化疗敏感组为首次采用铂类与紫杉醇联合为主的化疗方案后临床上获得缓解，完成化疗周期，停药6个月以内无复发；化疗耐药组为首次采用铂类与紫杉醇联合为主的化疗方案后临床上获得缓解，完成化疗周期，在化疗过程中或停药6个月以内复发。临床上卵巢癌复发的主要依据：血清CA125水平进行性升高，伴发胸腹水，影像学检查证实有复发病灶，原因不明确的肠梗阻。所纳入的SOC患者合计131例，在化疗结束后以电话、门诊或电子病历等方式进行追踪，其中死亡73例，失访13例，随访率为90.1%。随访时间6～60个月，中位随访时间为46个月。疾病无进展生存期(progression-free survival, PFS)是从化疗开始到疾病复发或死亡时间，总生存期(overall survival, OS)是从手术后第一天至死亡时间。本组中位PFS和中位OS分别为20个月和51个月。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化SP法染色，切片厚约4 μm，二甲苯脱腊，梯度乙醇(100%、95%、75%)水化。抗原修复5 min(pH 6.0柠檬酸盐修复液)，滴加内源性过氧化物酶阻断剂封闭，室温孵育10 min，滴加一抗(工作浓度为1 ∶200)，4 ℃过夜。次日，滴加二抗，室温孵育20 min，各步骤之间用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。DAB显色2 min，冲洗，苏木精复染2 min，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。GPSM2兔抗人多克隆抗体购自Proteintech公司，通用型试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2.2RT-PCR 利用Trizol试剂盒提取总RNA，分光光度计测量RNA的浓度和纯度。应用Prime Script RT reagent Kit反转录试剂盒(Takara公司，大连)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板对引物序列进行PCR扩增。GPSM2上游引物序列：5′-GACAAGGTGGGAGAAGCAAGAGC-3′、下游引物序列：5′-GGGGACCAGGGCAACCAAAAC-3′，GAPDH为内参照。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，预变性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合计45个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。表达水平根据2-ΔΔCt法进行分析。

1.3 结果判读GPSM2表达主要定位于细胞膜和(或)细胞质。按阳性细胞着色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞占肿瘤细胞百分比评分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项评分结果相乘为最终评分：0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性()。通过绘制ROC曲线，进而确定Cut off值为9。本实验将评分≥9分为高表达，<9分为低表达。本实验经两位经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片控制误差率。

2 结果

2.1 SOC中GPSM2的表达GPSM2主要表达于细胞膜和(或)细胞质，在卵巢良性肿瘤、交界性卵巢肿瘤、正常卵巢及输卵管组织中主要呈低表达或无表达，131例SOC中111例阳性，阳性率为84.7%(图1、2)。SOC组与其他三组相比，差异有统计学意义(P<0.001，表1)。

图1 A.正常卵巢中GPSM2的表达，SP法；B.正常输卵管中GPSM2的表达，SP法；C.卵巢良性肿瘤中GPSM2的表达，SP法；D.交界性卵巢肿瘤中GPSM2的表达，SP法 图2 A.SOC中GPSM2呈阴性，SP法；B.SOC中GPSM2呈弱阳性，SP法；C.SOC中GPSM2呈中度阳性，SP法；D.SOC中GPSM2呈强阳性，SP法

表1 卵巢、输卵管、卵巢良性肿瘤、交界性卵巢肿瘤、SOC中GPSM2的表达

2.2 SOC中GPSM2 mRNA的表达本组检测10例正常输卵管、10例正常卵巢和10例SOC新鲜标本的GPSM2 mRNA表达量，结果显示：GPSM2 mRNA在SOC中的表达量(1.75±0.15)高于卵巢(1.1 ± 0.16)和输卵管(1±0.13)，差异有统计学意义(P<0.01，图3)；卵巢和输卵管的GPSM2 mRNA表达量差异无显著性(P>0.05)。

图3 GPSM2 mRNA在正常输卵管、正常卵巢、SOC中的相对表达量

2.3 化疗耐药组与化疗敏感组中GPSM2蛋白表达差异131例SOC标本按NCCN指南对化疗耐药的分类标准进行分类，其中41例为化疗耐药组，90例为化疗敏感组。本组对免疫组化染色结果进行评分，化疗耐药组高表达率为58.5%，化疗敏感组高表达率为35.6%。由于两组评分结果不满足正态分布，通过两独立样本非参数检验Mann-WhitneyU检验进行比较，结果表明化疗耐药组GPSM2蛋白的表达水平高于化疗敏感组(P=0.032，表2，图4)。

图4 GPSM2在化疗耐药组和化疗敏感组中的免疫组化评分

表2 化疗耐药组与化疗敏感组GPSM2的免疫组化评分比较

2.4 SOC中GPSM2表达与临床病理特征的关系本组结果显示，SOC中Ⅲ+Ⅳ期组GPSM2的高表达率为48.4%，显著高于Ⅰ+Ⅱ期的28.9%(P=0.028)。化疗耐药组GPSM2的高表达率为58.5%，明显高于化疗敏感组的35.6%(P=0.014)，GPSM2表达与患者年龄、病理分级、有无淋巴结转移、腹水量、CA125表达水平、残余病灶、肿瘤大小无相关性(表3)。

表3 SOC中GPSM2表达与临床病理特征的相关性

2.5 GPSM2表达与SOC患者预后的关系使用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析GPSM2与PFS和OS的相关性。GPSM2高表达组患者的1、3、5年的累积生存率分别为76%、44%、22%，GPSM2低表达组患者的1、3、5年的累积生存率分别为90%、68%、52%。本组结果显示：GPSM2表达水平与SOC患者的OS(P<0.001)和PFS(P=0.018)均显著相关，GPSM2蛋白高表达提示SOC患者预后较差(图5)。

图5 GPSM2的表达水平与SOC预后的相关性：A.PFS分析；B.OS分析

2.6 SOC患者预后的独立危险因素本组各因素与PFS的单因素分析中，GPSM2表达水平、淋巴结转移、残余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平与PFS显著相关，由于FIGO分期已经包括腹水、淋巴结转移，剩余因素纳入Cox多因素分析，结果显示GPSM2(HR：1.481，95%CI：1.008～2.177，P=0.046)与FIGO分期(HR：3.277，95%CI：1.914～5.609，P<0.001)为预测PFS的独立危险因素(表4)。

表4 各变量与PFS的Cox单因素和多因素分析

本组各因素与OS的单因素分析中，GPSM2表达、年龄、淋巴结转移、残余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平与OS显著相关，由于FIGO分期包括腹水、淋巴结转移，剩余因素纳入Cox多因素分析，结果显示GPSM2(HR：1.877，95%CI：1.165～3.023，P=0.01)与FIGO分期(HR：3.346，95%CI：1.613～6.942，P<0.001)是评估SOC患者OS的独立危险因素(表5)。

表5 各变量与OS的Cox单因素和多因素分析

3 讨论

女性卵巢癌的恶性程度较高，5年生存率约为40%，造成卵巢癌预后差的关键因素是化疗耐药[4-5]。因此，寻找预测化疗耐药的肿瘤标志物对延长卵巢癌患者的生存期有积极的意义。

GPSM2属于G蛋白偶联受体的内源性调节因子，调控有丝分裂过程中纺锤体的正确定位[6]，维持对称性分裂，在G2/M期发挥重要作用[7-8]。GPSM2也受多种调节因子的调控，并通过与不同因子的相互作用，共同影响纺锤体的定位[9]。

本实验从mRNA和蛋白水平分别检测GPSM2的表达，结果显示其在SOC中高表达。该实验结果与GPSM2在肝癌、乳腺癌和胰腺癌组织中的高表达一致[10-15]，提示GPSM2与癌症的发生紧密相关。

卵巢癌临床治疗的一线化疗方案为铂类与紫杉醇联合化疗，紫杉醇是一类抗微管药物，使细胞分裂

在G2/M期停滞[16-17]，研究证实阻滞于G2/M期的细胞有明显的凋亡倾向[18]，近年GPSM2与肿瘤的文献报道较多，乳腺癌相关文献表明[10-11]GPSM2在G2/M期表达上调，且GPSM2高表达与紫杉醇化疗敏感性显著相关。敲除GPSM2，紫杉醇诱导G2期阻滞减少，紫杉醇可能通过抑制GTP活性使诱导周期停滞的能力下降，从而导致患者产生耐药性。以上表明，G2期停滞和微管调节可能是GPSM2的潜在机制。

乳腺和卵巢同属雌孕激素依赖性器官，可能具有同源性。本实验分析GPSM2在SOC化疗耐药的关系，发现耐药组GPSM2的表达水平高于敏感组，提示GPSM2高表达可能会减弱SOC患者对化疗药物的敏感性，但GPSM2在乳腺癌和卵巢癌中对化疗药物产生不同的效应，也许是由于器官的异质性导致GPSM2在不同肿瘤中的差异表现，也许是由于未考虑到铂类耐药。

此外，生存分析发现GPSM2高表达与SOC患者较差的OS和PFS显著相关。多因素生存分析发现，GPSM2、FIGO分期可以作为预测OS和PFS的独立危险因素，与高临床分期、化疗耐药的SOC患者往往有更差的预后相符。另外，在胰腺癌[12-13]和肝癌[14]中，上调GPSM2的表达能增加细胞的迁移和侵袭能力，提示GPSM2高表达可能会促进肿瘤的侵袭转移，对患者预后不佳。

综上所述，GPSM2与SOC发生、发展密切相关，GPSM2可能是评估化疗疗效和预后的重要指标。由于本实验对GPSM2与化疗药物的潜在机制了解不足，可能限制了对两者内在联系的深入探讨，尚待更多的实验进一步分析。