微卫星不稳定性与结直肠癌的研究进展*

孙伟杰 彭海霞

上海交通大学医学院附属同仁医院内窥镜室(200336)

根据2018年度全球癌症统计分析，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病率和死亡率在所有癌症中均位居第三位[1]。在我国，CRC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在所有癌症中分别位居第三位和第五位[2]，严重威胁我国人民的身体健康以及国民经济的发展。进一步深入了解CRC的发病和发展机制，对CRC患者的诊断以及治疗具有重要的临床意义。目前，越来越多的研究表明CRC主要由三种类型的遗传不稳定性造成，即微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)、染色体不稳定性以及CpG岛甲基化表型 (CpG island methylator phenotype, CIMP)[3]。其中，MSI在CRC中因具有独特的临床病理特征和分子生物学行为而引起广泛关注，了解其在CRC中的表达及其作用，有助于理解和掌握CRC的生物学行为，为CRC的早期诊断、预后判断以及个体化临床治疗方案的制定提供理论依据。本文就MSI的功能、实验室检测方法，以及在CRC发生发展、临床病理特征、预后评估和治疗等方面中的作用作一综述。

一、MSI的功能

微卫星DNA为一类高度重复的DNA序列，一般由1～6个核苷酸组成，重复10～60次，包括单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸等；通常散布于基因组的各个区域，包括基因编码区和非编码区。在DNA复制过程中，DNA聚合酶在这些区域更容易出错，通常由DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统进行修复。DNA-MMR系统是一种重要的DNA修复途径，对于维持DNA复制保真度起有关键作用，其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在MMR系统中发挥主要作用[4]。当MMR系统缺陷时，DNA复制错误无法修复并发生积累，导致MSI。研究表明，在伴有MSI的癌症患者中，DNA移码和错义突变的发生率增加100～1 000倍[5]，从而使大量原癌基因和抑癌基因发生突变，如BRAF、PIK3CA、PTEN等基因[6]，导致细胞增殖调控失衡，进一步导致癌症的发生。

二、MSI状态的判断

多重荧光PCR联合毛细管电泳法为目前判断MSI最精确的方法，其通过对肿瘤和正常组织内微卫星DNA进行碱基测序，从而分析突变状态。为确保准确性和判断的标准化，Buhard等[7]在2003年修订版Bethesda指南基础上推荐了更合适的五个单核苷酸微卫星参考小组(BAT25、BAT26、NR21、NR24和NR27)，其诊断MSI的特异性和敏感性均高达100%。一般情况下，通过微卫星参考小组中单核苷酸突变数目对MSI进行分类，任意两个或以上突变定义为微卫星高不稳定性(microsatellite instability-high, MSI-H)，任一突变为微卫星低不稳定性(microsatellite instability-low, MSI-L)，微卫星稳定性(microsatellite stability, MSS)为未发生任一突变。但这种方法价格昂贵且操作复杂，临床应用受限。MSI是由错配修复缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)引起的，通过免疫组化染色检测MMR基因蛋白产物(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的表达是另一种常用的检测方法[8]，若四种蛋白均表达表示错配修复完整(proficient mismatch repair, pMMR)，任意一种或多种蛋白缺失则表示dMMR。研究表明，免疫组化染色与基于DNA的MSI检测结果具有高度的一致性(93.4%)[9]，且具有良好的敏感性(92.3%)和特异性(100%)[10]。此外，免疫组化染色价格低廉，故临床广泛用于检测MSI。一般认为，dMMR归类为MSI-H，而pMMR归类为MSS/MSI-L。

三、MSI与CRC之间的联系

CRC患者中MSI的发生率约为15%，其中约2.5%为Lynch综合征(Lynch syndrome, LS)相关的CRC，其余12.5%则为散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer, SCRC)[11]。LS是一种非常典型的遗传相关性癌症模型，呈常染色体显性遗传，患者罹患CRC的风险高达82%[12]，又称为遗传性非息肉病性结直肠癌，其MMR系统缺陷是由于至少一种MMR基因发生胚系突变所致，其中90%以上为MLH1和MSH2基因胚系突变[13]，且MLH1较MSH2更为常见[14]。与LS不同，SCRC与遗传因素无关。通常由MLH1双等位基因异常超甲基化抑制其基因转录，从而导致MSI，且该过程与CIMP相关[15]。CRC-MSI患者中存在大量基因突变，其中部分基因的突变谱在LS和SCRC患者中不同，如BRAF基因。BRAF基因属RAS/RAF/MEK/ERK信号转导途径，可调节细胞增殖、分化和存活，其突变特征与CIMP相关[16]。在LS中，MSI患者不会发生BRAF基因突变[17]，而在SCRC中，约50%的MSI患者发生BRAF基因突变[18]。筛选出CRC中的LS患者具有重要的临床意义，可指导家族中的其他亲属进行癌症早筛，从而预防LS相关肿瘤的发生。但基于Bethesda指南筛查CRC中的LS患者，其敏感性较低(72%)[19]。在MLH1蛋白缺失的患者中，首先进行BRAF基因突变检测是确认LS较经济有效的方法[20]。如BRAF基因为野生型，则进行MLH1基因启动子区甲基化分析加以补充[21]，从而降低LS的漏诊率。

1. MSI与CRC的临床病理特征以及预后：不管是LS还是SCRC，伴有MSI-H的CRC具有相似的病理特征，包括肿瘤体积较大、近端结肠优势、分化程度差、丰富的粘液成分以及淋巴细胞浸润增加[22-23]，且相对于Ⅲ期患者，Ⅱ期CRC患者中MSI-H更常见[24]。MSI对预测CRC预后具有重要价值。与MSS/pMMR的肿瘤患者相比，MSI-H/dMMR的CRC患者的无疾病生存期(disease-free survival, DFS)和总生存期(overall survival, OS)更长[25-26]，这可能是由于MSI-H/dMMR肿瘤的淋巴细胞浸润较高所致[27]。但在转移性结直肠癌中，MSI-H/dMMR预示着较短的DFS和OS，这种情况可能是由BRAF突变所驱动[28]。

2. MSI与CRC的治疗：目前，CRC根治术后的化学治疗已成为恶性肿瘤治疗的核心。CRC的辅助化疗以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为基础用药。美国临床肿瘤学会专家组不建议在Ⅱ期结肠癌中常规给予辅助治疗[29]。然而，对于Ⅱ期患者是否进行以5-FU为基础的化疗仍存在争议。MSI对指导CRC化疗方案可能具有独特意义。目前普遍认为，无论是Ⅱ期还是Ⅲ期CRC患者，MSS/pMMR患者均可从基于5-FU的化疗方案中延长DFS和OS，而对MSI-H/dMMR患者而言，是否可从基于5-FU的化疗方案中获益尚有争议。一方面，有研究表明，MSI-H/dMMR患者并不能从基于5-FU的化疗方案中获益[30]。另一方面，有研究表明，伴有MSI-H/dMMR的Ⅱ期患者不能从基于5-FU的化疗中获益[31]，而在Ⅲ期CRC患者中，MSI-H/dMMR可从基于5-FU的化疗中获益[32]。基于此，2016年更新的NCCN指南明确提出，对于具有良好预后且对5-FU为基础的化疗方案缺乏益处的Ⅱ期MSI-H/dMMR患者，不推荐基于5-FU的化疗方案[33]。

近年免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)的开发使免疫治疗在癌症治疗中发挥重要作用[34]。目前FDA已批准数种临床试验免疫疗法用于治疗各种癌症[35]。目前针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性死亡受体1(PD-1)这两个免疫检查点的ICIs的研究较为多见。抗CTLA-4单克隆抗体是第一个进入肿瘤学临床试验的ICIs。美国和欧洲基于两项Ⅲ期临床试验将抗CTLA-4的ICIs ipilimumab批准用于晚期不可切除的黑色素瘤的一线治疗[36-37]，而对非黑色素瘤仅表现出适度的抗肿瘤作用[38]。CRC患者血清PD-1较正常人明显升高[39]，为抗PD-1的ICIs用于CRC的免疫治疗提供了理论基础。目前研究[40]表明，抗PD-1的ICIs具有更高的肿瘤选择性和更轻微的不良反应，且与MSI-H/dMMR相关。MSI-H/dMMR肿瘤可刺激免疫系统[41]，与MSS/pMMR肿瘤微环境相比，MSI-H/dMMR中PD-1表达更强，这有助于肿瘤细胞实现免疫逃避[42]。Le等[43]表明，抗PD-1的ICIs pembrolizumab对MSI-H/dMMR的CRC具有明显疗效，但其作用机制有待进一步深入研究。

四、总结

CRC是一种异质性很强的疾病，即使存在相同的病理阶段，其预后和个体治疗反应也存在显著差异。越来越多的研究揭示，CRC中存在一些潜在的生物学标志物，这些生物学标志物对于制定个性化的治疗决策非常重要。在CRC的众多生物学标志物中，MSI与CRC具有独特的生物学联系，可作为CRC患者预后的较为合适的标志物，以及提供较合理的化疗和免疫治疗的指导意见。2016年NCCN指南指出，建议对所有新诊断的CRC患者进行MSI测试。根据MSI分析，可将CRC初步分类为MSI-H、MSI-L和MSS肿瘤。临床上对CRC患者检测MSI具有重要的意义：①MSI-H患者有较好的OS和DFS。②MSI检测可用于指导CRC患者的化疗方案，虽然存在很多争议，但较为明确的是，MSI-H的Ⅱ期CRC患者并不能从基于5-FU的化疗中获益，故不推荐进行化疗。③MSI检测还可用于指导CRC的免疫治疗，抗PD-1的ICIs已在临床试验中表现出令人满意的临床收益，未来应集中研究其作用和耐药机制[44-45]。MSI检测是否能精确判断CRC患者的预后以及提供合适的个体化治疗仍需一系列大样本、多中心、前瞻性临床研究来验证，因此，需继续深入研究MSI在CRC中的作用，同时寻找更多的生物学标志物，联合MSI检测使CRC分期更合理，从而提供更准确的预后判断以及提供更合适的个体化治疗方案。