三颗针提取物含量测定及其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究

格桑卓嘎，四朗玉珍，拉巴次旦，吴金措姆，班旦

（西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009）

三颗针为传统的中药、民间药，用药历史悠久、疗效广泛，常用来替代黄柏，主治湿热泻痢、黄疸、湿疹、痈肿疮毒等，《中国药典》规定其来源为小檗科小檗同属多植物的干燥根［1］。全球有500 多种，我国有250 多种，主要分布在云南、西藏、四川三省地区，其中四川西部、阿坝州、凉山州、川南一带的三颗针产量丰富且较集中［2］。本属几乎都含有极强生物活性的异喹啉类生物碱，其含量与植物的产地、种类、部位等有很大关系，相关研究多通过高效液相色谱法（HPLC）以生物碱类化合物为指标作为质量标准［3］。

金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患病原菌，可引起人和动物多种感染性死亡，包括败血症、心内膜炎和脓毒症等。抗生素的使用及滥用催生并富集了耐药性菌株，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）感染已成为最难解决的感染性疾患，关键是其对许多抗生素有多重交叉耐药［4］。α-溶血素（Hla）是一种重要的外分泌蛋白，大量研究表明Hla 是金葡菌致病过程中最重要的毒力因子，尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎［5］。

产地是影响中药材质量的主要因素之一［6］，本研究通过HPLC 法测定了川产、藏产三颗针水提取物、醇提取物中的药根碱、巴马汀、小檗碱含量并进行比较，分析三颗针药材在不同产地的含量变化规律，为开发利用三颗针植物资源提供参考依据。

1 材料

1.1 菌种 金黄色葡萄球菌USA300。

1.2 药材 川产、藏产三颗针粉末。

1.3 试剂 盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品购自上海某生物科技中心；磷酸、三乙胺购自成都某耗材试剂公司；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸（色谱纯），三乙胺（色谱纯），TSB、TSA培养基购自青岛某生物技术公司。

1.4 仪器 高效液相色谱仪，电子分析天平，pH计，超净工作台，手提式高压灭菌器，电热恒温培养箱，旋转蒸发仪，SZ-9327自动三重纯水蒸馏器等。

2 方法

2.1 三颗针水、醇提取物的制备 取川产、藏产三颗针粉末40 g，以料液比1 g∶10 mL 浸泡30 min后加热提取2 次，每次1 h。取粉碎的川产、藏产三颗针粉末40 g，用甲醇以料液比1 g∶10 mL静置3d，提取2次。分别合并两次提取液，以4000 r/min离心5 min，取上清液，旋蒸浓缩至水提液体积的1/20左右，冷冻干燥后备用。

2.2 HPLC测定三颗针提取物的含量

2.2.1 色谱条件 使用BDS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测流动相：0.05 mol/L 磷酸/三乙胺∶乙腈（76∶24，pH＝2.4），检测波长：346 nm，每次进样量：10 μL，流速：1.0 mL/min。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀对照品，配制成浓度为80、40、20、10、4 μg/mL（盐酸小檗碱）以及40、20、10、4、2 μg/mL（盐酸药根碱、盐酸巴马汀）的对照品溶液。

2.2.3 线性范围测定 精密吸取各浓度盐酸小檗碱对照品溶液、盐酸药根碱对照品溶液、盐酸巴马汀对照品溶液，分别以10μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数及线性范围。

2.2.4 精密度试验 精密吸取4 μg/mL盐酸小檗碱、2 μg/mL 盐酸药根碱、2 μg/mL 盐酸巴马汀进样5次，按上述色谱条件测定，同时记录平均峰面积、RSD值。

2.2.5 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液10 μL，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 分析测定，同时记录盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀的平均峰面积、RSD值。

2.2.6 样品含量测定 分别取川产、藏产水提和醇提粉末各0.04 mg，用甲醇定容于5 mL 容量瓶中，摇匀，再取醇提样品2.5 mL于5 mL容量瓶中，作为样品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，重复3次，根据平均峰面积计算盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀的含量。

2.3 三颗针提取物亚抑菌浓度对金黄色葡萄球菌的影响

2.3.1 药物贮存液的制备 用DMSO（二甲基亚砜）将川产、藏产三颗针水提物和醇提物分别配成500 mg/mL 生药浓度，分装于5 mL灭菌离心管，用封口膜封口，置4℃储藏备用。

2.3.2 药物最小抑菌浓度的测定 采用微量肉汤稀释法测定三颗针对金葡菌USA300的最低抑菌浓度（MIC），其中第1孔至第8孔三颗针的质量浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL；第9 孔为阳性对照，培养基中只加菌液；第10 孔为溶剂对照，培养基中只加二甲基亚砜；第11 孔为空白对照。37 ℃条件下静置培养24 h，肉眼观察以无菌生长、澄清透明的质量浓度为MIC，重复测三次。

2.3.3 亚抑菌浓度下菌株生长曲线的绘制 金黄色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 摇床过夜培养16 h 至OD600为0.1，5 000 r/min 离心10 min，用生理盐水重悬。将菌悬液与TSB 培养基、药液混合，稀释成OD600约0.1 的菌悬液，使提取物的终浓度分别为其亚抑菌浓度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培养基、菌液为对照，37 ℃恒温培养，分别于0、1、2、3、4、5、6、8、12、24 h 测OD600值，记录并整理数据，绘制生长曲线。

2.3.4 结晶紫染色法检测生物被膜形成 金黄色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 摇床培养16 h，按1∶100 的比例稀释菌悬液。将菌悬液与TSB 培养基、药液混合，加入96孔板（200 μL/孔），使提取物的终浓度分别为其亚抑菌浓度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培养基、菌液为对照，37 ℃恒温培养24、48 h，取板，重复三次取平均值。

采用改良后的96孔微孔板BF定量检测方法检测：用灭菌后的PBS 洗涤3次，除去杂质和浮游菌；取200 μL 甲醇固定15 min 后舍弃甲醇溶液，晾干培养板，每孔加200 μL 0.1%结晶紫染色液染色15 min，用蒸馏水洗去多余的染色液，晾干；每孔加200 μL 33%冰醋酸溶液溶解结晶紫，利用酶标仪测定其OD595nm值，重复三次取平均值。

2.3.5 金葡菌溶血能力的测定 将金黄色葡萄球菌接种于TSB 培养基，于37 ℃200 r/min 摇床培养16 h，按100 倍稀释至新鲜培养基，分别加入不同浓度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）三颗针提取物于4 mL 离心管中，继续摇床培养（37 ℃，200 r/min）16 h，然后以10 000 r/min 离心5 min，收集培养物上清。将400 μL 培养物上清和400 μL 5%脱纤维兔血反应体系混匀，然后置于生化培养箱内37 ℃孵育20 min，10 000 r/min 离心5 min，收集反应体系上清并检测样品的吸光度值（OD543nm），重复三次取平均值。

以菌液为对照组，设定为100%溶血；以TSB为空白组，设定为0%溶血。每组样品的溶血比例与对照组作对比。

2.4 统计学分析 采用SPSS 22.0对试验数据进行统计分析；组间比较采用方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差异显著；用Prism 8.0 对图像进行分析。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制 以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀标准曲线，回归方程分别为Y＝30 975X+15 072，Y＝32 395X+30 359，Y＝32 87X+1 187.6。结果表明，盐酸小檗碱在4～90μg/mL（r＝0.9995），盐酸药根碱在2～50 μg/mL（r＝0.999 7），盐酸巴马汀在2～50 μg/mL（r＝0.999 6）范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

3.2 精密度试验 盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的精密度见表1。由表1 可见，三者的RSD均小于2%，说明仪器的精密性良好。

表1 精密度试验结果

3.3 稳定性试验 结果见表2、表3。川产、藏产三颗针水提取物、醇提取物样品在12 h内稳定性良好。

3.4 三颗针提取物样品含量的测定 结果见表4、表5。三颗针水提取物中药根碱、巴马汀、小檗碱的含量分别为0.476 1、0.436 9、4.792 mg/g（川产）和0.403 2、2.641 2、4.341 3 mg/g（藏产）；三颗针醇提取物中药根碱、巴马汀、小檗碱的含量分别为0.723、0.631 8、7.945 3 mg/g（川产）和0.768 8、5.115 7、8.067 6 mg/g（藏产）。

3.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定 川产、藏产三颗针水提取物对金黄色葡萄球菌的MIC 均为25 mg/mL，川产、藏产三颗针醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC均为12.5 mg/mL（见表6）。

3.6 三颗针在亚抑菌浓度下对金黄色葡萄球菌生长的影响 三颗针的抑菌作用具有浓度依赖性，1/2MIC时仍能在很长时间内抑制金黄色葡萄球菌的生长，1/4MIC仍有较强的抑菌作用，但是比1/2MIC 的抑菌能力弱，1/8MIC浓度时的抑菌作用不明显。

表2 三颗针水提取物稳定性试验结果

表3 三颗针醇提取物稳定性试验结果

表4 三颗针水提取物含量测定结果 mg/g

表5 三颗针醇提取物含量测定结果 mg/g

表6 三颗针提取物最小抑菌浓度测定结果 mg/mL

3.7 三颗针对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响 由图1、图2 可知，亚抑菌浓度下的三颗针提取物均对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300生物被膜的形成有影响，在24 h 时差异极显著，在48 h 时1/4MIC 和1/8MIC 的 药效开始降低。

3.8 三颗针对金黄色葡萄球菌α-溶血素表达的影响 随着浓度不断增加，颜色逐渐由红色变成无色，川产、藏产三颗针水提取物、醇提取物在1/2MIC时颜色达到最浅，接近空白组的颜色（P＜0.01）。川产、藏产醇提取物在不同浓度下可以使金葡菌的溶血能力下降，对α-溶血素有一定的抑制作用。醇提取物对USA300的抑制作用比水提取物更强，且川产三颗针醇提取物的抑制效果最好（图3）。

4 讨论

对三颗针化学成分研究较多的是小檗碱、药根碱、巴马汀、小檗胺等季铵类生物碱［7］，因此多通过HPLC 法同时测定几种生物碱含量，以综合评价三颗针的质量。本试验结果表明三颗针醇提取物中的3 种生物碱（药根碱、巴马汀和小檗碱）含量均高于水提取物，MIC试验结果表明醇提取物比水提取物具有更明显的抑菌效果，说明甲醇更容易提取三颗针中的有效抑菌物质。川产、藏产三颗针提取物中，含量最高的是小檗碱；藏产三颗针水提取物、醇提取物中的巴马汀含量都比川产的高。

图1 三颗针提取物对金黄色葡萄球菌生物膜24 h的消除作用

图2 三颗针提取物对金黄色葡萄球菌生物膜48 h的消除作用

图3 三颗针提取物与USA300培养物上清对兔红细胞的溶血作用

本试验表明三颗针醇提取物对USA300 的MIC（25 mg/mL）比水提取物（12.5 mg/mL）更高，抑菌效果更显著。抗菌活性试验表明，在三颗针有效活性浓度范围内，1/8MIC对金黄色葡萄球菌的生长几乎没什么影响，1/4MIC、1/2MIC 对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。生物被膜的抑制和清除试验表明，三颗针对USA300 24 h 和48 h的生物被膜均具有抑制和清除作用，且高剂量的清除作用明显，低剂量时USA300 呈现缓慢增长的趋势。

金黄色葡萄球菌感染后会产生多种毒力因子，特别是α-溶血素能诱导金葡菌产生细胞自噬反应，引起强烈的组织损伤，破坏宿主的免疫系统。本试验表明，随着三颗针提取物浓度的增加，金葡菌溶血能力呈逐渐下降的趋势，亚抑菌浓度下也能抑制致病菌分泌α-溶血素。

5 结论

三颗针提取物对MRSA 标准菌株USA300 有显著的抑菌作用，且对USA300 生物被膜的形成和α-溶血素有良好的抑制作用，但作用机制还有待于进一步研究。