5种常绿杜鹃组杜鹃杂交亲和性及播种繁殖研究

李晓花，童 俊，王凯红，李丹丹，单 文，王兆红，张乐华*

(1.江西省中国科学院庐山植物园，江西 庐山 332900； 2.武汉市农业科学院 武汉 430065)

在自然条件下，杜鹃花属(Rhododendron)植物存在从同种不同基因型之间到同亚属中不同亚组之间的杂交现象[1-2].杂交育种是目前国内外杜鹃花育种中应用最广泛、成效最显著的育种方法.张长芹等[3]开展了59种杜鹃花属植物杂交育种研究，发现常绿杜鹃组的大白杜鹃(R.decorum)×桃叶杜鹃(R.annae)、马缨杜鹃(R.delavayi)×大白杜鹃、桃叶杜鹃×马缨杜鹃的坐果率均在60%以上；并发现同亚属间杂交亲和力强，不同亚属间杂交不育.耿兴敏等[4-5]研究发现同亚属的杜鹃杂交亲和性较强，不同亚属间杂交存在生殖障碍、亲和性弱，而延迟授粉、3%食盐水或花粉培养液涂抹柱头、加热花粉等方法能有效克服亚属间远缘杂交授粉障碍，提高结实率和蒴果种子数及千粒重.庄平[6]研究了杜鹃花属植物种间杂交的向性，发现相同物种的正反交其结实率存在明显差异[7].国外大量的研究表明，杜鹃花属植物类群(亚属、组及亚组)的种间杂交有3种育性表现，双向可育，如映山红亚属(Subgen.Tsutsusi)×杜鹃亚属(Subgen.Rhodoendron)；单向不育，如映山红亚属×常绿杜鹃亚属(Subgen.Hymenanthes)；双向不育，如羊踯躅亚属(Subgen.Pentanthera)×映山红亚属[8-10].庄平在常绿杜鹃亚属内、杜鹃亚属内及不同亚属间的种间杂交中也发现不同程度的单向不育现象[2，6，11-12]；Ma等[13]研究证实，常绿杜鹃组的蜜腺杜鹃亚组(subsect.Thomsonia)的蓝果杜鹃(R.cyanocarpum)与同组不同亚组的马缨杜鹃存在自然杂交现象，并能进行不对称的双向交配；Hirao[14]采用微卫星标记技术研究发现，与远距离的植株间人工授粉相比，近距离授粉会导致R.brachycarpum有效基因流减少、后代繁殖力(种子发芽率、幼苗成活率)及适应性下降.

现有的资料显示，有关杜鹃花可育性的研究主要见于欧、美、日、澳等发达国家和地区，而国内杜鹃杂交育种起步晚，工作十分有限[4，15-16]，特别是缺乏对杂交种子的萌发与幼苗生长状况的跟踪研究.为探索常绿杜鹃组亚组间杂交可育性及其规律，本文以5种常绿杜鹃组(Sect.ponticum)杜鹃为材料，通过人工杂交授粉实验研究了其种间杂交的亲和性，并以坐果率、萌发率、绿苗率为指标对其可育性进行了综合评价，以期为我国杜鹃花杂交育种提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

以庐山植物园引种栽培的常绿杜鹃组(Sect.Ponticum)杜鹃为材料，共计4亚组、5种，分别是云锦杜鹃亚组(Subsect.Fortunea)的井冈山杜鹃(R.jinggangshanicum)、喇叭杜鹃(R.discolor)，耳叶杜鹃亚组(Subsect.Auriculata)的耳叶杜鹃(R.auriculatum)，银叶杜鹃亚组(Subsect.Argyrophylla)的皱叶杜鹃(R.denudatum)及树形杜鹃亚组(Subsect.Arborea)的马缨杜鹃.

1.2 方法

1.2.1 杂交组合设计 采用亚组间的正反交试验设计，共6个杂交组合(见表1).

表1 6个杜鹃杂交组合授粉实验的结果Tab.1 Results of pollination experiments on 6 cross combinations of Rhododendron

1.2.2 试验方法 人工授粉试验于2018年4月～7月在庐山植物园杜鹃园中进行.花蕾开放前2 d小心去除雄蕊、套袋，待柱头充满黏液后授粉；在杂交前1 d，采集相应杂交组合即将开放的父本花蕾放入常温玻璃瓶内，在晴天早上8∶00～12∶00取父本花粉进行人工授粉、套袋并挂牌.各杂交组合授粉数量不少于27朵，10 d后去除套袋使蒴果自然发育，10月底至11月授粉蒴果由棕黄色变褐色且蒴果顶部稍稍开裂时采收蒴果.

1.2.3 种子千粒重称量 将采收的杂交蒴果和母本自然授粉蒴果置于室内自然晾干，待蒴果自然开裂后取出种子.每个组合5份、每份200粒，用分析天平(Sartorius BSA224S-CW)称量，求平均值换算成千粒重.

1.2.4 种子萌发率、绿苗率统计 播种繁殖试验于2019年4月30日在杜鹃花繁殖温室内进行.泥瓦盆播种；播种基质为经福尔马林消毒后的腐殖土+珍珠岩+蛭石(3∶1∶1，V/V/V)混合基质；基质上盆后在表层铺设一层薄薄的洗净、剪碎的活体苔藓，轻压使苔藓与混合基质粘合；再将种子均匀撒播在苔藓上，喷水使基质完全浸透，最后用透明的塑料薄膜覆盖保湿.35 d后子叶展开，统计种子萌发数；65 d时统计幼苗的绿苗数.每个组合重复5次，取平均值.

1.2.5 数据处理 2018年10月～11月，蒴果成熟期统计坐果率(Capsul set，简称St) (%)=(坐果数/授粉花朵数)×100%；2019年6月上旬，统计种子萌发率(Germination rate，简称Gr) (%)=(5次重复萌发数之和/1000或实际播种种子数量之和)×100%；2019年7月上旬，统计绿苗率(Green seeding rate，简称Gs) (%)=(5次重复绿苗数之和/5次重复萌发幼苗数之和)×100%[17-18].采用SPSS 17软件对所得试验数据进行单因素比较(Duncan检验)，设P=0.05.

1.2.6 指标体系与等级划分 参照庄平的方法[18]进行各指标等级划分并进行改进(表2).1) 坐果率(St)为植物育性适应或适合度的常用指标，划分为3个等级：0≤低<20、20≤中<60、高≥60；2) 萌发率(Gr)为种子生活力常用指标，常结合绿苗率用以分析可育性，划分为3个等级：0≤低<15、15≤中<50、高≥50；3) 绿苗率(Gs)也为种子生活力常用指标，常结合发芽率、黄化率用以分析可育性，划分为3个等级：0≤低<10、10≤中<60、高≥60.考虑到单一指标的不完整性和片面性以及不同指标的重要性差异，赋予上述指标的权重和等级分值，累加后求出可育性值，对各杂交组合的可育性进行综合评价.设总权重(最高分值)为10分，绿苗率是主要可育性指标，给定其最高权重5分；其次为种子萌发率，给定最高权重3分；坐果率给定最高权重2分.各指标等级和权重分值分配方案见表1.单项得分之和为各杂交组合的总分值，依据总分值将可育性划分为4个等级，即0≤不育<4、4≤低<6、6≤中<8、高≥8，对应类型分别为不育型、弱育型、可育型和高育型.

表2 杜鹃花杂交育种可育性指标等级与权重分配Tab.2 Fertile index grade and their weight allocation of cross breeding of Rhododendron

2 结果与分析

2.1 各杂交组合坐果率比较

2.2 母本和各杂交组合种子千粒重比较

由表1可见，5种杜鹃亲本自然授粉结实种子的千粒重由重至轻依次为井冈山杜鹃、耳叶杜鹃、皱叶杜鹃、马缨杜鹃和喇叭杜鹃，分别为362、291、234、158、120 mg.方差分析表明，除井冈山杜鹃种子千粒重显著大于其他杜鹃外，其他4种杜鹃间无显著差异.

2.3 母本和各杂交组合萌发率及绿苗率比较

2.3.1 萌发率比较 5种杜鹃亲本自然结实种子的萌发率由高至低依次为井冈山杜鹃、耳叶杜鹃、皱叶杜鹃、马缨杜鹃和喇叭杜鹃，分别为59.30%、48.20%、18.70%、8.80%和6.50%(见表2).方差分析表明，井冈山杜鹃与耳叶杜鹃种子萌发率无显著差异，但两者显著高于其他3个物种；皱叶杜鹃种子萌发率居中；马缨杜鹃和喇叭杜鹃种子萌发率无显著差异但显著低于其他3个物种.

2.3.2 绿苗率比较 绿苗率是种间杂交可育性的重要指标，种子活力越强、绿苗率越高.5种杜鹃亲本自然结实种子苗的绿苗率由高至低依次为的皱叶杜鹃、喇叭杜鹃、马缨杜鹃、耳叶杜鹃和井冈山杜鹃，分别为100%、92.36%、90.91%、84.02%和58.52%(表1).方差分析表明，皱叶杜鹃绿苗率显著高于其他4种杜鹃，而喇叭杜鹃、马缨杜鹃、耳叶杜鹃之间差异不显著，但三者显著高于井冈山杜鹃.

图1 6个杜鹃杂交组合坐果率、萌发率与绿苗率Fig.1 Capsul set，germination rate and green seedling rate on 6 cross combinations of Rhododendron

2.4 各杂交组合可育性综合评价

图2 6个杜鹃杂交组合可育性综合评价Fig.2 Fertility assessment on 6 cross combinations of Rhododendron

3 讨论与结论

杜鹃花属植物自交亲和(self compatibility，SC)与自交不亲和(self incompatibility，SI)现象并存，不同分类类群间的人工杂交亲和性或可育性与双亲的系统发育及染色体倍性密切相关，总体趋势是亲缘关系越近、亲和性越强，自交亲和的亲本种间杂交可育性大于自交不亲和亲本[1，6，19]；而不同亚属间的种间杂交存在明显的生殖障碍——不育[3]或育性较弱[12，19-21]；常绿杜鹃组种间自然杂交现象普遍，也有跨亚组间的自然杂交现象[13，19]，其组内异种杂交可育性较强且大多双向可育[1-2].

3.1 各杂交组合的坐果率

3.2 母本和各杂交组合种子千粒重

3.3 母本和各杂交组合种子萌发率与绿苗率

3.4 各杂交组合育性综合评价

育性是植物杂交育种成败的关键.本研究中，6个杂交组合坐果率为57.14%～88.89%、种子萌发率为12.60%～65.00%、绿苗率为65.07%～90.45%，综合评价得分最达8～10分，均为高育型类型，表明常绿杜鹃组亚组间杂交是可行的，以前人研究结果一致[1-2].

综上所述，本研究中虽然不同杂交组合间坐果率、种子千粒重、萌发率和绿苗率存在一定差异，且亲本间有正反交不对称现象，并存在种子千粒重、绿苗率下降等问题，但所有杂交组合均达到高育型水平，说明常绿杜鹃组亚属间杂交育种是完全可行的.今后工作中应以自然授粉结实率高、可育性强的杜鹃为母本，进一步拓展杂交种源，并借助于倍性育种、胚胎拯救、体细胞融合、基因工程等现代育种技术，改良杜鹃花性状、培育新种质，为我国杜鹃花资源发掘与利用提供支撑.