口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的运用

口蹄疫是一种发生在偶蹄动物中的疾病，是由口蹄疫病毒诱发的急性、热性、高度接触性传染性，血清型以O型与A型分布较广泛，危害性最大[1]。本次试验研究主要采用液相阻断ELISA法追踪检测某牧场O型口蹄疫免疫抗体滴度，希望对O性口蹄疫预防工作的开展提供更科学的指导。

1 材料和方法

1.1 样品某牧场牛群均接受口蹄疫O型灭活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫后的1200份奶牛血清样品。

1.2 器材酶标仪、恒温温箱、(5～50μl)移液器及器配套设施、微量抗原抗体反应板、ELISA试剂盒（中国农科院兰州兽医研究所）。

1.3 试验流程

1.3.1 奶牛免疫严格依照产品说明书上设定的免疫剂量与方法，对本牧场奶牛接种口蹄疫F型灭活疫苗，在2免3周后采血并检测免疫效果。

1.3.2 抗原抗体反应于96孔U 型微量血凝板上进行检测，以10份样品为例，需要使用2块板，血清采用倍比稀释方法进行（空白孔未加入样品）。

在U型反应板上，利用50μL/孔的量PBST 2倍稀释血清，被检血清于第1～10列由1∶8稀释到1∶128，于第11列稀释阳性对照血清，由1∶2稀释到1∶256；A12～B12孔稀释阴性对照血清，由1∶2稀释到1∶4。

使用PBST稀释液将口蹄疫O型病毒抗原稀释到工作浓度，血凝板检测样品血清与阴阳性血清（50μL/孔），加入等量工作浓度的病毒抗原以后，血清稀释度加倍，封板，37℃温育90min。

将抗原抗体混合液从U型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O型免抗的ELISA板上，50uL/孔，封板，37℃温育60min。

用PBST连续洗板3～5次，拍干，按50uL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工作液（红色），封板，37℃温育30min。

网上洗板3～5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1∶1比例混匀，加入混匀后的底物溶液50uL/孔，置37℃显色15min。

显色反应结束后，加终止液50uL/孔，终止反应，在酶标仪上读取D450nm值。

洗酶标板等在37℃恒温箱中培育15min以后，将每个孔洞内加入50uL终止液终止反应，于酶标仪上读取D492mm值。

1.4 结果判断将病毒抗原对照评价D492mm值的50.0%设为临界值，被检血清稀释孔D492mm值大于临界值的孔定义为阴性孔，反之为阳性孔。

2 结果

2.1 病毒抗原对照D492mm值1200份被检样品，共使用60个ELISA板，240个病毒抗原对照D492mm值区间为1.0～2.0。

2.2 免疫抗体效果对本牧场奶牛进行2免3周后检测蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体，共采血检测1200份血样，ELISA抗体效价≥1∶128。1178份判断为O型口蹄疫抗体阳性，保护为98.17%；ELISA抗体效价1∶64～1∶128择抗体滴度，取中间值1∶90，则判断为可疑，50.0%以上保护。免疫抗体滴度＜1∶64的样品有21份，判断为O型口蹄疫抗体阴性，无需予以保护。

3 讨论

在检测口蹄疫过程中，兽医临床上主要采用无生物安全要求的血清学诊断技术，常见用的有液相阻断ELISA、间接血凝试验，其多用于动物疫苗免疫抗体监测领域中，功能是评估疫苗免疫动物持有的抗体水平。合理使用口蹄疫免疫检测技术，能为口蹄疫综合防治提供更可靠的技术支持。

液相阻断ELISA具有高敏感性（基本上达到了100.0%），特异性偏高（约96.0%），并且重复性优良，检测速度更快，在大批量血清样品检测领域中表现出较高适用性，能更确切的评估疫苗免疫效能[2]。

本次试验分析中采用代号JYBL-2014-5-21的口蹄疫O型灭活疫苗抗体效价去检测提供较可靠的试验数据，其能更有效、科学的指导牧场O型口蹄疫防疫工作，为疫病预防提供更可靠依据。本次试验研究结果表明，抗体效价保护率约为98.17%。