长链非编码RNA在急性髓系白血病发病中作用机制的研究进展

何雨晨，徐英英，葛繁梅

延安大学附属医院，陕西延安 716000

急性髓系白血病(AML)是一种病因学、临床、细胞遗传学和分子异质性疾病，其特征是未成熟髓系祖细胞增殖失控，凋亡受阻[1]。文献[2]报道，基因异常和表观遗传学改变是AML发病机制中的重要环节。长链非编码RNA(lncRNA)是一类对于基因表达水平具有调控作用的重要生物分子，参与了染色体失活、染色体修饰、基因印记、细胞分化调控及细胞周期调控等生物过程。lncRNA来源多种多样[3～10]，癌症易感性候选者15(CASC15)、长链非编码RNA HOXB簇反义RNA3(HOXB-AS3)、人H19基因(H19)、homeobox反义基因RNA(HOTAIR)、INK位点反义非编码RNA(ANRIL)、SBF2的反义RNA(SBF2-AS1)、长基因间非编码RNA 00662(LINC00662)等lncRNA通过不同的作用机制在AML中发挥重要作用。现就lncRNA在AML发病中的作用机制研究进展情况作一综述。

1 CASC15在AML发病中的作用机制

尽管lncRNA的基因结构都非常相似，但不同的lncRNA的功能却有很大差异，它们在细胞水平上发挥着多种作用，包括调节转录和翻译，导致基因表达的改变。其中一个功能是在顺式中调控基因表达，导致lncRNA表达下调或过表达，从而使染色体邻近基因的表达发生调控，如CASC15。CASC15是一种保守的lncRNA，编码lncRNA的基因在基因组中表现出位置保守性，包含非常短的物种间高度保守序列[11]。有学者发现[12]，在细胞水平上CASC15调控细胞存活、增殖及其染色体邻近基因SOX4的表达。CASC15敲低后的差异调节基因丰富了阴阳1(YY1)转录因子的预测转录靶标，且CASC15增强了YY1介导的SOX4启动子的调控。在AML患者中，与inv(16)和DEK-NUP214易位的患者相比，RUNX1-RUNX1T1易位患者的CASC15上调；而在t(8；21)的AML病例中，CASC15的表达最高。这代表了该CASC15导致runx1易位在白血病中有一定的作用机制。实验证实，CASC15的强制表达导致发育中的髓样偏倚并且整体上减少了移植和菌落形成，在整个实验过程中，CASC15表达细胞的这种表型是持久的，并且在CASC15的细胞中保持了相对的髓样偏倚，在实验结束时，对血淋巴器官进行了分析，发现整体移植减少，并且出现了发育中的髓样偏倚。CASC15的表达在伴有t(8；21)的AML病例中最高，其在细胞中的表达导致造血系统凋亡增加、移植减少，证明CASC15表达可能限制细胞增殖。在分子水平上，CASC15通过调节SOX4的表达起作用，这可能是通过调节转录因子(如YY1)的活性来实现的，这将会为lncRNA在AML中的研究开辟一条新道路。

2 HOXB-AS3在AML发病中的作用机制

HOXB-AS3是一种细胞质lncRNA，通过增加参与细胞周期进展和DNA复制的基因表达来促进细胞增殖。HOXB-AS3是位于17q21，32染色体HOXB(人类同源基因B)簇上的lncRNA，通过选择性剪接产生8个转录变异。HOX(同源基因)在细胞增殖、造血和白血病发生中起着重要作用[13]。Huang等[14]用慢性病毒携带作为对照，两种HOXB-AS3shRNA相互作用的绿色荧光蛋白(GFP)感染髓系OCI/AML3(人急性髓细胞性白血病细胞)，然后对感染细胞进行分选增殖试验，结果发现携带HOXB-AS3shRNA的细胞比携带对照shRNA的细胞生长缓慢，这就证实了HOXB-AS3的变性有一定的抗增殖作用。如果在两个骨髓细胞系中敲除HOXB-AS3，HOXB-AS3的下调通过降低进入S期的细胞数量，抑制OCI/AML3的增殖。HOXB-AS3的下调抑制了细胞的增殖，HOXB-AS3在不影响HOX簇表达的情况下，增强了细胞周期进展和DNA复制中几个关键因子的表达。在AML中，HOXB-AS3表达高的患者生存期短于HOXB-AS3表达低的患者，高水平的HOTXB-AS3表达与较短的总体生存期明显相关。因此，HOXB-AS3的高表达是AML患者的不良预后因素，可成为AML的一个新的治疗靶点[14]。

3 H19在AML发病中的作用机制

H19编码了一个2.3 kb的lncRNA，在胚胎发育和生长控制中起至关重要的作用。H19与邻近基因IGF2相互印迹，导致H19与母体等位基因差异表达，IGF2与父本等位基因差异表达，H19的异常表达或印迹缺失与多种癌症包括血液学恶性肿瘤有关[15]。Zhang等[16]发现，AML患者H19表达明显高于对照组。因H19是一个印迹基因，并受DMR/ICR(差异甲基化区域/印迹控制区域)中甲基化模式的控制，所以Zhang等利用RT-qMSP(特异检测DNA甲基化修饰的定量PCR)发现H19在AML中的DMR/ICR甲基水平与对照组相似，并从医学癌症(TGGA)数据库中对H19甲基化和表达的进行了独立评估，进一步证实了AML中H19过表达不依赖于H19甲基化。通过生物信息学分析发现H19在白血病中与细胞增殖、分裂、分化、凋亡、造血等有关。在体外实验中，Zhang等验证了H19对AML的促白血病作用，因此所有白血病细胞都出现H19表达增加。若敲除H19，发现细胞的增殖显著减少，凋亡显著增加，证明H19在白血病细胞中具有促增殖和抗凋亡的作用。总之，H19在白血病发生发展中发挥了重要作用，可作为AML的预后和生物标志物，成为潜在的治疗靶点。

4 HOTAIR在AML发病中的作用机制

HOTAIR参与了多种肿瘤的发生，如HOTAIR的上调和HOXA5的甲酰化在乳腺癌的发生发展过程中起关键作用[17]。HOTAIR与homeoboxA5(HOXA5)相互协同作用，与非小细胞肺癌的生长和转移密切相关[18]。目前发现HOTAIR是AML患者复发诊断和预后不良的潜在预测因子，而且高表达HOTAIR可能通过调控细胞增殖和凋亡来参与AML的进展。Wang等[19]做了以下验证。首先，在AML样品和收集的细胞中检查HOTAIR的表达；接下来，在AML细胞中进行功能增强或丧失功能实验，以探索HOTAIR对AML的作用；然后，测量HOXA5启动子甲基化，HOTAIR和Dnmt3b(DNA甲基转移酶)之间的关系，还检测了HOXA5的表达和细胞增殖/凋亡相关基因；最后，进行体内试验以评估裸鼠中的肿瘤形成，以研究HOTAIR和HOXA5在细胞凋亡和增殖中的作用。最后得出结论，发现HOTAIR在AML中上调；当HOTAIR沉默、HOXA5过表达时，AML细胞增殖减少，凋亡增加；HOTAIR被观察到招募Dnmt3b和增加HOXA5启动子甲基化；且在体内沉默HOTAIR和上调 HOXA5的表达均可诱导AML细胞凋亡，减少其增殖。综上，HOTAIR在AML中过表达，而沉默HOTAIR可通过降低Dnmt3b抑制 HOXA5启动子的甲基化，从而抑制AML细胞的增殖，诱导细胞凋亡。因此，下调HOTAIR是一个治疗AML的潜在靶点。

5 ANRIL在AML发病中的作用机制

ANIRIL在多种癌症[20]已被发现表达异常，近来发现其在AML患者中表达明显增高，并调控其细胞存活。Sun等[21]发现，ANRIL在AML患者发病时升高，在完全缓解后下降。在功能上，ANRIL表达的降低导致糖摄取下降，抑制AML细胞在体内外的维持；在机制上，ANRIL被发现可以抑制脂联素受体(AdipoR1)的表达，这是葡萄糖代谢的关键调控因子。ANRIL和AdipoR1基因敲除均降低了AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)和沉默信息调节因子1(SIRT1)的磷酸化表达水平，即存在一个ANRIL-AMPK/SIRT1信号通路，使ANRIL通过调节AdipoR1来触发AML细胞的存活，沉默AdipoR1表达可促进细胞衰老、凋亡和抑制细胞增殖。与ANRIL的作用相似，表明ANRIL调控AML中的AdipoR1的表达。ANRIL的下调或过表达导致AdipoR1蛋白水平下调或上调，揭示了ANRIL与AdipoR1在AML中的相关性，ANRIL通过AdipoR1/AMPK/SIRT1的糖代谢途径调控细胞存活。敲低ANRIL和AdipoR1导致细胞对葡萄糖的摄取下降。综上，ANRIL的功能是通过在AML中调控葡萄糖代谢关键调控因子AdipoR1及其下游因子AMPK、SIRT1实现的，说明ANRIL可促进恶性细胞存活和细胞葡萄糖代谢，加速AML进展，它将为AML的治疗提供新的思路。

6 SBF2-AS1在AML发病中的作用机制

SBF2-AS1是SBF2的一个2708nt的反义RNA，位于11p15.1位点[22]，与多种癌症的发生与发展密切相关[23]。Tian等[24]发现，SBF2-AS1可能在AML进展中扮演一种致癌lncRNA的角色。他们通过GEPIA(基因表达谱数据动态分析)数据库测定了SBF2-AS1在AML中的表达，结果显示与正常样本比较SBF2-AS1在AML样本中的表达显著增加，且其高表达与AML患者总体生存率差呈现正相关关系。他们进一步用qRT-PCR(逆转录定量PCR)测定SBF2-AS1在AML细胞中的表达，结果发现与HS-5(人骨髓基质细胞)细胞相比，AML系(THP-1(单核巨噬细胞)、U937(人组织细胞淋巴瘤细胞)和HL60)SBF2-AS1的表达显著增加。下调SBF2-AS1在THP-1和HL60细胞中的表达，发现SBF2-AS1的抑制显著降低了AML细胞增殖。采用流式细胞术研究SBF2-AS1对AML细胞凋亡及细胞周期的影响，发现SBF2-AS1的抑制显著增加了THP-1和HL60细胞的凋亡率，且减少SBF2-AS1的表达显著抑制了G0/G1期的THP-1和HL60细胞的增殖。SBF2-AS1的靶点是miR-188-5p，SBF2-AS1的抑制显著增加了AML细胞中miR-188-5p的表达，而miR-188-5p的直接靶点是ZFP91。研究发现，SBF2-AS1的抑制显著降低了AML细胞中mRNA和蛋白水平上ZFP91的表达，而miR-188-5p的抑制剂可以消除这种抑制作用，即SBF2-AS1可以通过调控miR-188-5p的表达来激活ZFP91(锌指蛋白91)。这说明AML中SBF2-AS1的升高降低了miR-188-5p的活性，增加了ZFP91的表达，最终促进了AML细胞的增殖。综上，SBF2-AS1主要通过调控miR-188-5p/ZFP91信号通路促进AML的进展，下调SBF2-AS1的表达将会作为AML新的治疗靶点。

7 LINC00662在AML发病中的作用机制

LINC00662位于染色体19q11和2085 bp，是一种新发现的LncRNA，参与调控口腔鳞状细胞癌[25]、肺癌[26]、胃癌[27]等肿瘤细胞的生物学功能。Liu等[28]检测了LINC00662在AML患者和正常对照组骨髓中的表达水平。qRT-PCR检测结果显示，AML患者骨髓组织中LINC00662表达明显高于正常对照组，证明了LINC00662在AML组织和细胞系中均有高表达。转染LINC00662shRNA后AML细胞中LINC00662的表达显著减少。实验数据显示，LINC00662基因的下调显著降低了AML细胞的增殖，且LINC00662的抑制抑制了AML细胞集落形成。此外，沉默LINC00662可显著增加AML细胞凋亡。总之这些结果表明，LINC00662的抑制对AML细胞生长具有抑制作用。miR-340-5p(一个肿瘤抑制miRNA)是LINC00662的靶miRNA，实验结果显示敲除LINC00662可上调miR-340-5p在AML细胞中的表达，而过表达LINC00662可下调miR-340-5p在AML细胞中的表达。总之，LINC00662与 miR-340-5p相互作用，调控其在AML细胞中的表达。生物信息学分析表明，ROCK1(RHO相关的含卷曲螺旋蛋白激酶1)是miR-340-5p的靶基因，通过荧光酶联实验证实miR-340-5p直接与ROCK1的3′-UTR结合，负调控AML细胞中ROCK1的表达，ROCK1 基因敲除显著降低了AML细胞的增殖，而增加了AML细胞的凋亡。提示通过上调miR-340-5p下调ROCK1，抑制LINC00662的表达，从而抑制AML细胞的增殖。

综上所述，lncRNA作为一种新的、早期的、较敏感的生物标记物，不仅可以用于早期筛查AML，而且可以通过修饰其不同的作用的靶点用于疾病的靶向性治疗。CASC15、H19、HOTXB-AS3、HOTAIR、ANRIL、SBF2-AS1、LINC00662均可促进AML细胞的增殖，但作用机制复杂，要将其应用于临床研究还需要更多的学者对其的确切分子机制进行更加深入地研究。