Mic60介导线粒体功能障碍在CKD发生发展中作用机制的研究进展

王锦，张爱青，甘卫

华南京医科大学第二附属医院，南京210003

慢性肾脏病(CKD)是指持续3个月以上的肾脏结构或功能异常，主要特征是肾功能的进行性丧失[1]。CKD的进展具有不可逆性，常发展为终末期肾脏病(ESRD)，且尚无有效治疗手段可以逆转该过程。近年来，CKD的患病率和病死率逐年上升。ESRD患者往往只能依赖透析或肾移植来延续生命。因此，迫切需要开发新的治疗方法来预防或延缓CKD的发生发展。肾脏的生理功能高度依赖线粒体的稳态，诸多证据证明线粒体功能障碍与CKD的病理生理过程有关[2]，包括肾小管损伤、氧化应激、细胞凋亡、炎症和纤维化等。线粒体功能障碍的一些特征性表现已在CKD中被发现，如线粒体内膜重塑和线粒体形态的改变、线粒体氧化应激的增强、线粒体生物发生和ATP生成的显著减少[3 ,4]。目前关于线粒体功能障碍在CKD发生发展过程中的确切作用和机制仍需进一步探究，以期寻找新的治疗靶点，改善CKD的临床转归。线粒体内膜蛋白Mic60介导的线粒体功能障碍可能是CKD发生的重要原因之一。Mic60具有维持内膜结构、组织呼吸复合物、线粒体蛋白质生物合成及运输、线粒体内外膜间磷脂转移等功能。Mic60表达异常，不仅导致线粒体结构崩解，“巨大线粒体”的形成，也可介导氧化磷酸化、线粒体动力学、生物发生等功能紊乱[5]，与CKD的发生密切相关。本文对Mic60介导线粒体功能障碍在CKD发生发展中的作用机制作一综述。

1 Mic60概述

Mic60是一种由核基因编码的线粒体蛋白，存在两种亚型(88、90 kDa)。超分辨率显微镜显示，Mic60锚定于线粒体内膜，主要结构域暴露在线粒体膜间隙，由一个N端跨膜结构域和一个面向膜间空间的大型C端结构域组成，其跨膜区域主要负责把蛋白质锚定在内膜上，而它的C端结构域对维持线粒体形态至关重要。这个位置不仅使其成为线粒体接触位点和嵴组织系统(MICOS)复合体的一部分，还使其与位于线粒体外膜的分选和装配机械(SAM复合体)的成员相互作用，形成线粒体膜间隙桥接复合体[6]。MICOS是线粒体内膜上的一个大型多蛋白复合物，对维持线粒体嵴结构、形成膜接触位点和蛋白输入至关重要，是线粒体结构和功能调节的核心枢纽[7]。Mic60作为MICOS复合物的核心组分，进化上高度保守，可直接或间接与其他组分相互作用。Mic60表达下调可导致MICOS其他组分不稳定，MICOS复合物解体。线粒体嵴是线粒体内膜向线粒体基质折褶形成的一种重要结构，不仅增大了线粒体内膜面积，还富集多种线粒体功能蛋白，比如ATP合成酶、细胞色素C等重要蛋白，是细胞有氧呼吸的重要场所[8]。Mic60的丢失可导致线粒体嵴结构的重组，Mic60缺陷细胞中的线粒体嵴紊乱，表现出同心环状或轮状结构，取代正常的内膜结构[9]，这也是Mic60表达异常的各种细胞和动物模型中的一种效应。

2 Mic60介导线粒体功能障碍在CKD发生发展中的作用机制

2.1 参与线粒体呼吸功能障碍 Mic60不仅是维持线粒体结构的核心蛋白，其在线粒体的功能调节上也起着至关重要的作用。Mic60的缺失对细胞生存能力产生不利影响，可能涉及线粒体嵴重排、线粒体呼吸受损、体内平衡受损、裂变和融合受损以及与Mic60缺乏相关的蛋白输入中断等线粒体损伤效应[10]。这些效应似乎与线粒体膜结构和MICOS的重组有关。除呼吸缺陷和动力学功能障碍外，Mic60的缺失也与线粒体相关的凋亡和自噬有关，不仅通过调节凋亡诱导因子及抗凋亡因子，控制细胞凋亡过程，还可招募泛素连接酶Parkin到受损线粒体，引发线粒体自噬。此外Mic60的抑制会影响线粒体DNA(mtDNA)的稳定性，导致异常的类核形成、mtDNA损伤的积累和mtDNA转录的减弱，并可能进一步损害线粒体功能。Mic60的以上功能与CKD相关，Mic60介导的线粒体呼吸功能障碍、动力学紊乱以及线粒体相关凋亡、自噬是CKD发病的主要驱动因素。

ATP耗竭和活性氧(ROS)合成增多是CKD的关键环节[11]。生理情况下，分布于线粒体嵴上的五个酶复合物(Ⅰ～Ⅴ)组成的氧化呼吸链，通过氧化磷酸化(OXPHOS)作用形成ATP，而在此过程中，呼吸链上的电子脱漏可使得部分氧转化成ROS。ROS是重要的第二信使，低浓度的ROS存在是正常现象；然而，过多的ROS生成会损伤mtDNA，导致电子传递链功能受损、ATP合成减少、线粒体外膜通透性增高，细胞色素C释放，诱发细胞凋亡。肾脏是高度需要能量的器官，当能量产生耗竭或者ROS产生过量时，则会诱导氧化应激，促进细胞凋亡、炎症、纤维化等病理生理过程，直接与CKD的启动和发展过程相关。线粒体嵴是线粒体产生ATP的主要场所，而线粒体嵴结构的维持需要Mic60的参与[12]。此外，呼吸复合物的组装也已被证实与Mic60参与组成的MICOS有关，因此猜测Mic60与线粒体呼吸功能存在某种联系。John等[13]已经将Mic60描述为维持线粒体嵴结构和线粒体呼吸的关键蛋白，认为细胞中Mic60表达的缺失或下调，导致同心分层的嵴结构，紧密包裹的膜层和内隔室可能阻碍离子和代谢物的交换，进而导致膜电位和ROS的生成增加，氧化磷酸化功能缺陷。由于氧化磷酸化的缺陷，增加的代谢产物不能产生相应的ATP产物。近年来，Yang等[14]发现，抑制Mic60可通过影响mtDNA的转录，导致线粒体OXPHOS复合物酶活性降低，最终影响电子传递链，导致呼吸功能障碍。在Mic60敲低的HeLa细胞中，由mtDNA编码的OXPHOS复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ活性下调，而由核编码的酶复合物活性无明显变化，因此证明Mic60表达下调所致的OXPHOS酶活性下降，至少部分是由mtDNA转录水平降低引起。Suzuki等[15]报道了一种新合成的吲哚衍生物，即有丝分裂酸5(MA-5)，其可增加线粒体疾病患者的细胞ATP水平和成纤维细胞的存活率。值得注意的是，MA-5可以独立于氧化磷酸化和电子传递链调节线粒体ATP的合成。此外，进一步研究MA-5在CKD中的作用机制，对缺血-再灌注损伤和顺铂通过直接靶向Mic60的肾病模型给予MA-5可显著减少蛋白尿，改善肾功能。另外的检测显示，MA-5以内膜嵴交界处的线粒体蛋白Mic60为靶标，过表达的Mic60增加了基础的ATP水平，而用MA-5处理则放大了这种效应。这种在不影响线粒体呼吸链活动下导致线粒体ATP的产生增加和ROS减少的MA-5-Mic60效应，使人们对线粒体功能障碍相关的CKD治疗不再局限于传统的抗氧化治疗。

2.2 参与线粒体动力学紊乱 线粒体是高度可塑的细胞器，可通过融合和裂变过程不断改变其形状和大小，这一过程统称为线粒体动力学。线粒体融合包括线粒体外膜(OMM)和内膜(IMM)的融合，主要由线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)和视神经萎缩因子1(OPA1)调控，位于线粒体外膜上的线粒体分裂蛋白1和下游裂变蛋白1负责线粒体分裂。生理状态下，线粒体的分裂和融合处于动态平衡，这种动态平衡不仅可以修复线粒体的结构，还可以维持线粒体DNA的遗传完整性，保证细胞的能量代谢；在细胞损伤或应激过程中，细胞动力学发生改变，导致线粒体断裂、外膜通透性增强和内膜嵴重塑、导致凋亡因子释放和细胞死亡。Lee等[16]发现，在糖尿病小鼠肾小管细胞凋亡和高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡过程中，线粒体出现明显的断裂和嵴重塑，碎片化增加。Zhan等[17]研究也证明了线粒体断裂是糖尿病肾病肾小管损伤的重要病理特征，同时，在缺血性和顺铂诱导的肾病模型中，阻断线粒体断裂具有肾保护作用。上述研究表明，线粒体过度分裂和融合受阻导致的线粒体断裂与CKD发生发展密切相关。线粒体动力学的稳定需要多种蛋白质和介质的调控，除了上述提及的直接介导线粒体融合和分裂的关键蛋白。Mic60作为连接线粒体内外膜的桥接蛋白，近年来被认为是一种新的线粒体动力学调节器[18]，哺乳动物细胞系中Mic60不仅影响多种裂变和融合蛋白水平以及相应的裂变和融合率，Mic60还与OPA1相互作用，调节线粒体之间的内膜融合，并参与嵴重塑[19]。有证据表明，Mic60/MICOS复合物与OPA1的关系是调节两个线粒体内膜融合的关键。此外，Mic60的缺失还会影响线粒体分裂和生物发生的关键步骤——mtDNA类核形成和mtDNA转录。虽然目前没有直接证据证明Mic60在CKD发生发展过程中通过调节线粒体动力学功能发挥作用，但在其他系统比如神经系统帕金森病的发病中，已经发现了线粒体裂变-融合动力学与神经元中Mic60丰度之间的关系，证明了Mic60的增加抑制了神经元中线粒体的分裂[20]。

2.3 参与线粒体相关凋亡 线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一。线粒体损伤后向细胞质释放细胞色素C和凋亡诱导因子AIF，在Bax、Bid等凋亡因子和抗凋亡因子Bcl-2等参与下激活Caspase-9；Caspase-9将进一步裂解为Caspase-3，最终诱导细胞凋亡。线粒体凋亡通路在哺乳动物细胞中具有重要的功能。高度依赖能量的肾脏细胞对缺血、缺氧、炎症和中毒等病理刺激敏感，很容易发生功能和结构损伤，其中足细胞和肾小管上皮细胞的凋亡，是CKD重要的病理特征，也是其发展为ESRD的关键[21]。足细胞损伤和凋亡可导致蛋白尿的发生，并发生在许多最终进展为CKD的肾小球疾病中；具有代谢活性和增殖潜能的肾小管上皮细胞在多种致病因素的作用下，也易发生损伤，促使线粒体向细胞质释放细胞色素C，诱导肾小管上皮细胞凋亡，最终导致肾小管损伤和肾小管间质纤维化，促进ESRD的发展。Madungwe等[22]发现，Mic60表达下调通过凋亡诱导因子(AIF)-腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-dependent机制和细胞周期阻滞诱导细胞凋亡，该机制涉及促凋亡的线粒体因子，如AIF、PARP。AIF是一种核编码蛋白，成熟的AIF在线粒体定位于线粒体内膜。当AIF位于线粒体内时，具有延长细胞生存时间的作用，而从线粒体易位到细胞核时，可诱导染色体凝集和DNA断裂，激活Caspase无关的细胞死亡信号。PARP1是参与DNA修复和程序性细胞死亡等多种细胞过程的蛋白质家族成员[23]，其线粒体定位是由Mic60的存在和丰富程度来调节，当DNA损伤轻微时，聚腺苷二磷酸核糖反应机制修复损伤。然而，当DNA损伤广泛时，PARP耗尽细胞的NAD+和ATP，细胞无法修复。Mic60表达水平的降低导致线粒体肿胀和嵴损伤，这一效应与ROS生成和诱导的钙蛋白酶活性增加有关，也与细胞内ATP生成和线粒体膜电位的显著降低有关。总之，敲除Mic60可增加钙蛋白酶活性，线粒体结构降解，导致线粒体功能的关键性降低，而线粒体功能失调是通过AIF-PARP机制和核碎裂导致细胞凋亡增加的原因。Chen等[24]发现TNF受体相关蛋白(Trap1)，是一种定位与线粒体的分子伴侣蛋白，在细胞凋亡和肾小管间质纤维化中起重要作用，在单侧输尿管梗阻小鼠肾病模型中，Trap1可以通过维持Mic60的表达，保护肾小管上皮细胞的线粒体结构和功能，产生抗凋亡和抗纤维化的作用。上述两个研究表明，Mic60的丰度与细胞凋亡的调节密切相关。

2.4 参与线粒体自噬 线粒体自噬是一种针对线粒体降解的巨噬细胞自噬，它能清除受损的线粒体，回收并重新分配有用的成分，在线粒体质量控制和损伤后修复中起重要作用。其中线粒体激酶诱导的推定激酶(Pink1)/泛素连接酶(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬是清除受损线粒体的主要通路[25]。线粒体分裂引发线粒体自噬，线粒体膜通透性转换孔的打开和线粒体膜电位的下降触发线粒体自噬。随后，Pink1选择性地招募Parkin到受损的线粒体，泛素化OMM蛋白，如Mfn1、Mfn2和电压依赖性阴离子通道，这些通道依次与p62、sequestosome 1和Ambra 1相互作用，参与招募自噬体膜和新的吞噬体。线粒体自噬具有促进细胞分化和延缓衰老等生理功能。研究发现，糖尿病肾病小鼠中，线粒体自噬显著减少，使用线粒抗氧化剂可通过增加Pink1介导线粒体自噬进行线粒体质量控制，改善糖尿病肾病肾小管损伤[26]。蛋白过载的肾小管上皮细胞损伤中，线粒体功能紊乱，激活Pink1/Parkin信号通路及其介导的线粒体自噬，以此清除受损线粒体，改善线粒体功能，使用Parkin小干扰RNA(siRNA)则减少上述保护机制。在5/6肾切除模型中，由于肾脏高灌压，线粒体体积增大和分裂水平降低，线粒体自噬减少[27]，因此，CKD的线粒体自噬水平以降低为主，激活线粒体自噬可改善线粒体和肾脏细胞功能。Akabane等[28]发现，Mic60是腺苷酸环化酶激动剂或表达蛋白激酶A(PKA)的底物，其Ser528残基经历了PKA依赖的磷酸化后，无法与PINK1产生瞬时相互作用，导致PINK1减少和Parkin定位错误，而缺乏磷酸化的Mic60突变体促进了Parkin的线粒体定位，这证明了PKA介导的Mic60磷酸化可负调控PINK1和Parkin启动的线粒体清除。

Mic60作为MICOS的核心蛋白，其在维持线粒体功能上起着重要的调控作用。有关Mic60介导的线粒体相关疾病研究已广泛开展[29]，但Mic60在CKD中确切的作用和机制尚未可知。鉴于Mic60在线粒体功能中的重要调节作用，以及线粒体稳态失衡与CKD发生间明确的因果关系，从Mic60介导线粒体功能紊乱角度深入研究，有望为CKD干预发掘新的靶点。