四逆汤对肝母细胞瘤细胞生物学行为的影响及机制

盛凤，张春艳，闫玉兰，李丽丽,3，刘晓智,3，吴问汉

1天津市第五中心医院，天津300450；2天津市滨海新区中医医院；3天津市早产儿器官发育表观遗传重点实验室；4北京大学第一医院

肝母细胞瘤是儿童恶性肝肿瘤中最常见的一种，约占80%[1]。手术切除是肝母细胞瘤治疗的基础，但大多数患儿在诊断时因肝脏占位大，无法达到根治性手术切除；而且肝母细胞瘤自身对放疗和化疗均不敏感，致使其预后不良[2]。因此，寻找新的救治手段或开发新的药物，提高靶向治疗效果，改善患者预后，是当前肝母细胞瘤治疗的主要任务。中医学认为，肿瘤成因多为瘀毒、痰凝、气血壅滞、饮食劳倦、人体正气亏损等。有专家认为，正气内虚是肿瘤发生发展的根本原因，寒乃生积与不温不散是中医药治疗肿瘤的新思路，而温阳法贯穿肿瘤治疗的始终[3～6]。目前已证实，温阳散寒汤药对肿瘤生长具有明显的抑制作用[7～10]。为了进一步探析和验证温阳药物对肝母细胞瘤的疗效及作用机制，2018年1月～2019年5月，本课题组选用经典温阳方——四逆汤，观察其对肝母细胞瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响，探讨其潜在的作用机制，为温阳散寒汤药治疗肝母细胞瘤提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 四逆汤所含中药由天津市滨海新区中医医院药学科提供；人肝母细胞瘤株Hep G2购自美国ATCC公司；胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；低氧诱导因子1α(HIF-1α)、蛋白激酶B1(AKT-1)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)抗体均购自美国Abcam公司；MTT试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Transwell培养板购自美国HyClone公司。

1.2 四逆汤水煎液的制备 参照2015版《中国药典》，(制)附子∶干姜∶炙甘草=3∶2∶3，按处方7日量称取药物，加入12倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，趁热过滤，药渣再加10倍量水，煎煮30 min，合并2次滤液，浓缩至1 g/mL。于4 ℃下，14 000 r/min离心10 min，用0.45 μm滤膜过滤，在无菌条件下用0.22 μm滤膜过滤，即得四逆汤水煎液[11]。

1.3 细胞培养与药物干预 Hep G2细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM中，培养条件为37 ℃、5% CO2，饱和湿度。每3～4天按1∶3比例进行细胞传代。将贴壁过夜的Hep G2细胞随机分为两组，对照组用等体积的PBS溶液继续培养，四逆汤组用终浓度为50 mg/mL的四逆汤继续培养[4]，均培养48 h。

1.4 细胞增殖能力检测 采用MTT实验。取对数生长期的Hep G2细胞，用含0.25% EDTA的胰酶消化后以1×104个细胞/孔均匀接种在96孔板内，过夜贴壁，用DMEM/高糖基础培养基饥饿5 h。然后将其按以上分组方式加入PBS、四逆汤分别培养1、2、3、4、5、6 d，于酶标仪上测定波长490 nm处吸光度值，计算细胞增殖率。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。将Hep G2细胞接种于6孔板，待细胞密度达95%以上时，用10 μL无菌枪头在6孔板垂直划线，PBS洗去脱落细胞记录初始划痕宽度(S0)。随后按1.3分组处理细胞，待96 h后终止实验并记录划痕宽度，记作S1，(S0-S1)/S0×100%即为细胞迁移率。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验。将Matrigel胶放置4 ℃冰箱过夜至溶解，并用DMEM高糖基础培养基稀释后取100 μL加入Transwell小室上室，于37 ℃温育使胶凝固。胰酶消化Hep G2细胞，调整细胞至2×105个/L，取细胞悬液200 μL接种至上室，然后按1.3分组处理细胞，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL，24 h后取出Transwell上室，擦去小室上层细胞，以苏木素进行细胞染色，计数进入Transwell小孔的细胞数，计算其百分比。

1.7 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。按1.3分组处理细胞，用无EDTA的胰酶消化结合机械性吹吸获得单细胞悬液(30 000个细胞)，经漂洗、固定后送检。用流式细胞仪计数各组凋亡细胞，并计算凋亡率。以上由国家纳米技术与工程研究院协助完成。

1.8 细胞内HIF-1α、AKT-1及PGC-1α蛋白表达检测 采用Western blotting法。按1.3分组处理细胞，用PBS清洗细胞后加入适量蛋白裂解液，提取细胞总蛋白。BCA法测定各组蛋白质的浓度，然后经制胶(SDS-PAGE胶)、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL显影、成像等步骤，检测HIF-1α、AKT-1和PGC-1α的表达量。以Actin为内参。各蛋白与内参的灰度值比值即为其相对表达量。

2 结果

2.1 四逆汤对Hep G2细胞增殖的影响 对照组Hep G2细胞增殖率为(62.25±5.67)%，四逆汤组为(35.50±2.96)%。与对照组比较，四逆汤组Hep G2细胞增殖率低(P<0.05)。

2.2 四逆汤对Hep G2细胞迁移能力的影响 干预96 h，对照组细胞迁移距离为(57.41±4.97)μm，四逆汤组为(23.59±4.04)μm。与对照组比较，四逆汤组细胞迁移距离短(P<0.05)。

2.3 四逆汤对Hep G2细胞侵袭能力的影响 对照组向Transwell下室迁移的细胞比例为(37.25±4.91)%，四逆汤组为(18.55±4.25)%。与对照组比较，四逆汤组向Transwell下室迁移的细胞比例低(P<0.05)。

2.4 四逆汤对Hep G2细胞凋亡的影响 对照组细胞凋亡率为(4.23±0.74)%，四逆汤组为(21.59±4.03)%。与对照组比较，四逆汤组细胞凋亡率高(P<0.05)。

2.5 四逆汤对Hep G2细胞HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白表达的影响 对照组HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白相对表达量分别为1.68±0.08、1.40±0.05、1.41±0.03，四逆汤组分别为1.01±0.03、0.88±0.02和0.79±0.03。与对照组比较，四逆汤组HIF-1α、AKT-1、PGC-1α蛋白相对表达量低(P均<0.05)。

3 讨论

四逆汤是回阳救逆的代表方剂，方用生附子为君，温壮命火，破阴逐寒，通行十二经脉；干姜辛热，守而不走，温中散寒，助附子破阴回阳，为臣药；炙甘草辛甘温热，扶阳益气，甘缓峻烈以护阴液，更有持续药力以防虚阳脱散之用。三药配合，相须相使，共同发挥温中散寒，回阳救逆的功效。肿瘤是细胞增殖、分化、凋亡异常的疾病，其复发和转移也是治疗的难点。本研究通过细胞实验进一步证实四逆汤能够有效抑制Hep G2细胞增殖，同时能降低Hep G2细胞的迁移和侵袭能力，并能够显著诱导细胞凋亡。以上结果表明，四逆汤可有效抑制肝母细胞瘤细胞的恶性生物学行为。

四逆汤抑制肝母细胞瘤恶性生物学行为的机制尚不清楚。为此，课题组通过查阅文献，发现相关研究[12，13]表明，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路在肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管形成等过程中均发挥至关重要的作用。AKT是PI3K下游极为重要的效应分子，也是一种抗凋亡调节因子。作为癌变责任基因，AKT-1能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡。肝癌作为绝大多数实体肿瘤之一，其中存在着缺氧微环境，且HIF均呈高表达[14，15]。而HIF可通过诱导肿瘤血管生成，细胞能量代谢等相关基因的表达而促进肝癌的发生。此外，PGC-1α是线粒体生物合成最重要的调节因子，能促进线粒体功能、增强呼吸能力，促进癌细胞的远处转移[16]。本研究检测了以上三个具有代表性癌变责任蛋白的表达，结果发现，四逆汤能够明显降低HIF-1α、AKT-1和PGC-1α蛋白表达。由此推测，四逆汤对肝母细胞瘤的抑制作用与HIF-1α、AKT-1和PGC-1α相关通路的作用相关，但具体的作用机制仍未阐明。相关研究[17～20]表明，本研究选取的三个较具代表性的癌变责任基因HIF-1α、AKT-1和PGC-1α均可以被小泛素相关蛋白SUMO化修饰。四逆汤对肝母细胞瘤的抑制作用是否通过以上三个癌变责任蛋白的SUMO化修饰产生的联系引起，仍需后期深入研究。