禽流感血凝和血凝抑制试验操作

鲁卫红/甘肃省临夏州动物疫病预防控制中心 731100

1 实验操作准备要点

1.1 标本处理和保存血凝和血凝抑制试验主要以静脉血为主。要使实验室诊断得出正确结果，采集静脉血后需要及时做血清分离，保证血清清透无溶血。通常是分离后及时检测，如果不能及时检测，待检血清在4℃冷藏环境中保存不超过5d，如果待检时间超过一周，需要保存在-20℃冷冻环境中，检测时取出自然融化，避免血清反复冻融影响效价。

1.2 稀释液配置血凝和血凝抑制试验中所用的PBS稀释液必须遵循“现配现用”的原则，严格控制PBS液的PH值确保PH7.0～7.2。

1.3 1%红细胞悬液制备需要选取3～5只常规实验证明体内无禽流感病毒抗体的健康公鸡，最大限度的避免公鸡红细胞发生自凝现象。翅下静脉血采集到加有抗凝剂的试管中并上下颠倒混匀，待采集样本在离心操做中缓慢加入PBS液混合，按2000r/min的离心5min，反复三次离心即可，每次离心结束后都吸出上层溶液和白细胞膜弃去，制成红细胞泥加入阿氏保护液，4℃冷藏保存备用，不超过5d。整个制备过程中避免用力太大引发红细胞破裂出现溶血现象，临用时用PBS液制成1%红细胞悬液，每次实验结束后剩余的1%红细胞悬液应弃去，切勿保留至下次再用。注意：最终配置好的悬液静放后出现了红色上清液，是出现了溶血现象，此时的红细胞悬液不可用。

2 试验操作要点

2.1 HA试验HA试验主要是测定抗原的效价，通常做3个重复就可以精准得出抗原效价。加入1%红细胞悬液后在室温（18～20℃）静置40min后观察试验结果。倾斜反应板，观察试验后红细胞是否存在泪滴状流淌。能够完全让红细胞凝集的抗原最高稀释度是该种抗原的血凝效价，该效价为1个血凝单位。HA试验主要是对血凝效果进行初步判断，结合判定结果开展4HAU抗原检测，校正最终检验结果。配制好4个HAU的病毒抗原后，需做血凝回归实验4孔4个重复，其结果判定如下：

如果HA效价判定精准，4HAU抗原检测时回滴到第一二孔时将发生凝集，在后面两孔将出现流淌现象；如果HA效价判定出现偏差，4HAU抗原检测时浓度将出现偏高或者偏低。当4HAU抗原浓度偏低时候需要添加抗原，当4HAU抗原浓度偏高时需要补充一定的PBS

2.2 HI试验在HI试验时需要设立阴性和阳性对照组。操作过程中为了减少误差，不论是在HA或HI实验中倍比稀释时保持每次稀释次数尽量一致（5～8次），稀释时吸头插入液面以下但不可过深，避免孔中液体产生气沫，倍比稀释后再加任何液体全部采用先加对照孔，其次按低浓度孔向高浓度孔顺序添加，需要遵循“从后往前”加原则。加入抗原后在室温（18～20℃）条件下静置30min，再添加1%红细胞悬液，在加抗原和红细胞悬液时吸头不要深入液面，尽量悬空垂直加样。加入红细胞后需要混匀（反应板四边轻轻手拍20次，严禁使用震荡器混匀），避免红细胞下沉。每次静置时反应板需封口，以免水分蒸发影响结果，孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时迅速判定，可将反应板倾斜45°。判定最高稀释度时需要结合红细胞对照孔，与对照孔的流淌速度一致，泪滴大小一致的稀释倍数孔为检测样品的最终效价。整个实验过程中要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感性的凝集素也可与所有抗原血清发生非特异性反应。

2.3 结果判定试验结果将出现病毒对照孔完全凝集和稀释液对照孔无凝集。

2.3.1 如果出现整板无红细胞凝集（流淌）现象，首先考虑：a未加4单位抗原或4单位抗原配制过低。b 环境温度过高或读数时间拖延。

2.3.2 出现整板红细胞凝集（不流淌）现象，原因有：a红细胞、PBS液受污染或保存时间过长。b 4HAU抗原配制失败或滴加失误。只有阴性对照孔血清滴度≦2log2，并且阳性对照孔血清误差±1个滴度的时候该项试验结果才具有可参考性。测定孔血凝抑制试验效价以完全血凝抑制4HAU抗原血清的最高稀释倍数为基数，将基数作为HI的滴读。即红细胞沉于孔底中心，呈纽扣状，将板倾斜呈泪滴状流淌。禽流感HI价≦2log2判定试验阴性，HI价等于3log2为可疑，需重复实验，HI价≥4log2为阳性。

3 结束语

总之，为了确保禽流感血凝和血凝抑制试验的精准性，必须注重每个实验细节，严格按照实验标准流程开展，做好试验环节质量把控。最大限度降低试验误差，为预防和控制禽流感得出精准的意见。