瞿麦毛状根的高效诱导及培养

郝爱平， 薛巨坤， 吴启康， 任如意， 魏继承， 国会艳

(牡丹江师范学院， 黑龙江 牡丹江 157011)

早在20世纪80年代就有科研工作者研究植物毛状根的应用，但到目前为止研究最多的还是药用植物，药用植物毛状根分泌的次生代谢产物可作为治疗某些疾病药物的有效成分之一。如单萜吲哚生物碱文多灵和长春碱仅在药用植物长春花﹝Catharanthusroseus(L.)G. Don〕中合成，是医学上生产抗癌药物长春花碱和长春新碱的2种重要前体。SUN等[1]通过转基因技术使长春花毛状根中含有文多灵，还在毛状根中检测出2种新的代谢物环氧T16H和洛可辛碱。QI等[2]在丹参毛状根中用含有0.5%的Triton X-100的蛋白提取缓冲液成功分离出相对较多的CYP76AH1蛋白，为深入分析丹参酮代谢途径提供了依据。研究表明，毛状根诱导技术还可以有效提高番茄(Solanumlycopersicum)中番茄红素的含量[3]。齐墩果酸是治疗肝病的辅助药的有效成分之一[4]。而万寿菊(TageteserectaL)经发根农杆菌15834菌株处理后可以获得毛状根，毛状根经茉莉酸处理后其合成齐墩果酸的能力增加了10倍。ALI等[5-7]研究表明，植物毛状根在大规模积累次级代谢产物、调节代谢途径和抗菌药的研究开发等方面具有重要意义。

瞿麦(DianthussuperbusL.)又名野麦、石桂花等，系常用中药，为石竹科植物瞿麦的带花地上部分，主产于河北、河南、辽宁等地[8]。瞿麦除具有观赏价值外，还含有5-羟基-7，3′，4′-三甲氧基二氢黄酮、5，3′-二羟基-7，4′-二甲氧基二氢黄酮、Β-菠甾醇、胖大海A等成分[9]，因此瞿麦在临床上对治疗糖尿病性水肿、慢性前列腺炎、各种出血及腹泻等疾病有独特效果[10]。瞿麦还含有大黄素、积雪草酸等多种活性成分，对乳腺癌、肾癌等细胞具有显著抑制作用[11-14]。由于药用植物本身的次生代谢产物存在产量低和不稳定等特点，而毛状根培养具有生产周期短，次生代谢成分合成能力强，能合成新化合物等优势被广泛应用于药用植物应用研究[15]。目前，鲜见关于瞿麦的毛状根研究的报道。为此，选用2种常用的发根农杆菌A4菌株和R1601菌株侵染药用植物瞿麦的叶片，探究影响毛状根诱导的因素，优化诱导毛状根培养条件，提高瞿麦毛状根的诱导率，以期为瞿麦毛状根的大规模培养奠定基础，并为大规模开发利用瞿麦次级代谢产物提供一条有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

瞿麦种子，购于河北省安国中药材推广站，瞿麦为经种子萌发的无菌苗，实验室培养。

发根农杆菌A4菌株和R1601菌株，均保存于牡丹江师范学院分子实验室。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 将保存的菌株从-80℃冰箱取出，融化预先灭菌的LB(100 mL)固体培养基，待培养基冷却至55℃左右时在超净工作台内加入卡那霉素(50 mg/mL)100 μL，轻轻摇动培养基使卡那霉素混合均匀，然后倒平板。待平板冷却凝固时，用接种环蘸取少量菌液，之字形平板划线接种于培养基上，并用封口膜封好。将平板置于28℃恒温培养箱黑暗倒置培养48 h使其活化。在超净工作台内，用移液枪加入卡那霉素于无菌的三角瓶内，用提前灭菌的牙签尖端挑取培养48 h左右的单菌落，并将牙签置于含有LB液体培养基三角瓶内，随后将三角瓶用封口膜封好放置在振荡培养箱中培养，培养箱设置为28℃，180 r/min培养至菌液浓度A600OD值为0.4～0.6时将三角瓶从摇床中取出备用。

1.2.2 瞿麦叶片预培养 将瞿麦无菌苗从MS固体培养基中用无菌的镊子轻轻取出，放置在无菌的培养皿中，用刀片将无菌苗的根部和叶柄切除，把叶片放置在加入1/2MS固体培养基中，25～26℃光照预培养2 d。

1.2.3 侵染与共培养 分别将A4及R1601菌液倒入50 mL离心管中，5 000 r/min，离心10 min。离心后的菌液在超净工作台内倒出上清液，加入等体积的1/2MS液体培养基，振荡离心管使菌体悬浮。然后每个无菌的三角瓶内加入100 μL的乙酰丁香酮(AS)，再将菌液倒入三角瓶内，封口膜封好，把三角瓶放进振荡培养箱，28℃，180 r/min，震荡培养30 min。把预培养的叶片用无菌的手术刀把叶片的尖端和基部各切1个伤口，再把带伤口的叶片放进菌液中，放置振荡培养箱中，28℃，180 r/min，分别震荡侵染3 min、5 min、10 min和15 min。随后将叶片从菌液中用镊子夹出来，在无菌的吸水纸上吸去多余的菌液，以防菌液浓度过大、长势过盛，使得叶片致死。再将叶片转接到加入了AS的1/2MS固体培养基上，放在恒温培养箱中23℃，黑暗倒置共培养2 d。观察记录不同侵染时间下的外植体数量、毛状根平均数，计算诱导率。

诱导率=长出毛状根外植体/侵染外植体总数×100%

1.2.4 除菌和继代培养 用无菌的镊子将暗培养后的外植体在无菌的吸水纸上吸去多余水分放入含有头孢的1/2MS固体培养基。为了抑制发根农杆菌A4菌株和R1601菌株的过度生长，前3次除菌时每隔2 d除菌1次，此时头孢的浓度为500 mg/L。当后期发根农杆菌比较少时每隔5 d除菌1次，为了避免因除菌培养基内头孢含量过高致使瞿麦叶片变黄，再把头孢的浓度调为400 mg/L。当毛状根生长至3～5 cm时，用无菌的手术刀在超净工作台内从毛状根基部将毛状根切除，再用镊子把毛状根轻轻转移至继代培养基，每5 d需要继代1次。继代培养基分别为1/2MS固体培养基、1/2MS液体培养基、MS固体培养基和MS液体培养基。转接到1/2MS液体培养基和MS液体培养基时，放置在振荡培养箱25℃，150 r/min振荡培养。转接在1/2MS固体培养基和MS固体培养基时则需要25℃光照培养。观察瞿麦毛状根在不同类型培养基的扩繁情况。

1.2.5 毛状根的分子鉴定 采取常规CTAB法分别提取未侵染瞿麦组培苗和瞿麦毛状根基因组DNA。以瞿麦毛状根DNA为模板，菌株A4及R1601作为阳性对照，瞿麦未经侵染的外植体DNA作为阴性对照进行PCR扩增。反应体系为10 μL混合酶试剂[Premix TAP(Takapa TAP Version 2.0 plus dye)、2 μL rolB引物、7 μL水和模板1 μL]。反应程序：95℃5 min预变性，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，进行30个循环后72℃保温5 min。PCR扩增结束后，将其扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 A4和R1601菌株不同侵染时间对瞿麦毛状根诱导率的影响

由表1和图1A～D可知，A4菌株分别侵染瞿麦叶片3 min、5 min、10 min和15 min后，经过一段时间的培养，均能诱导出毛状根，说明A4菌株适于诱导瞿麦毛状根。瞿麦侵染3 min、5 min、10 min和15 min的毛状根诱导率分别为52.90%、81.2%、73.3%和56.2%，说明侵染时间超过5 min后，毛状根的诱导率随侵染时间的延长而下降，故A4菌株侵染瞿麦叶片5 min时诱导率最高，毛状根分支较多，长势良好。

由表1和图1E～H可知，R1601菌株分别侵染瞿麦叶片3 min、5 min、10 min和15 min后，经过一段时间的培养，均能诱导出毛状根，说明R1601菌株适于诱导瞿麦毛状根。但不同侵染时间的诱导率有所差别，当侵染时间为10 min时，其毛状根的诱导率最高，为78.60%。侵染时间为0～10 min随着侵染时间的延长，毛状根的诱导率随之增高，当侵染时间大于10 min，毛状根的诱导率降低且叶片褐化严重直至最后干枯死亡，故R1601菌株最佳侵染时间为10 min，此时诱导率最高毛状根长势较好。

表1 A4和R1601菌株不同侵染时间的瞿麦毛状根诱导率

2.2 不同培养基类型对瞿麦毛状根增殖的影响

由图2可知，1/2MS固体培养基上瞿麦毛状根的每根毛状根上面都新生长出了很多乳白色绒毛状的侧根，而MS固体培养基上的毛状根只有3根毛状根新长出了侧根，且侧根的数量比1/2MS固体培养基少。所以瞿麦毛状根在1/2MS固体培养基中比MS固体培养基长势更好。由于1/2MS培养基大量元素减少了50%，由此推测瞿麦毛状根在低盐培养基中长势更好。

此外，瞿麦毛状根在1/2MS液体培养基和MS液体培养基中培养21 d后的重量明显增加，新长出的毛状根较纤细并呈现出抱团现象。然而，毛状根在1/2MS液体培养基的长势比MS液体培养基好。对比毛状根在1/2MS固体培养基、MS固体培养基、1/2MS液体培养基、MS液体培养基生长状况发现，毛状根在1/2MS液体培养基中的生长状况优于固体培养基。

由图3可知，瞿麦毛状根质量在1/2MS液体培养基中前4次继代时呈上升趋势，在第5次继代时质量有所下降。毛状根在第1天放入1/2MS液体培养基中增殖时质量为0.336 g，当培养至第16天时质量为2.915 g，仅15 d毛状根质量约增加7.7倍，说明瞿麦毛状根适于在1/2MS液体培养基中扩繁。在第5次继代时毛状根的质量下降可能是由于毛状根的老化造成。

2.3 瞿麦毛状根的分子鉴定

由图4可知，2～5号点样孔上方在425 bp左右出现明显条带。其中1号点样孔没有条带，4～5号点样孔上方出现的条带与2号、3号点样孔阳性对照结果一致，表明农杆菌A4及R1601的Ri质粒中的T-DNA所含有的rolB基因已经成功整合到瞿麦的基因组中，说明试验所得毛状根是经过A4及R1601侵染诱导后得到的。

3 结论与讨论

瞿麦叶片经A4菌株和R1601菌株侵染后均能诱导出毛状根，侵染时间不同，诱导率也不相同，用A4菌株侵染5 min时诱导率最高，为81.2%；用R1601菌株侵染10 min时诱导率最高，为78.60%。瞿麦毛状根在1/2MS液体培养基中扩繁效果最好。

另外，在诱导药用植物瞿麦毛状根时发现，毛状根的诱导率与瞿麦叶片的年龄和外植体的大小有很大关系。当瞿麦叶片年龄和外植体的大小都较小时，随着培养时间的增长，外植体褐化程度也会越来越严重，直至最后死亡。当选用的瞿麦叶片年龄较大且外植体较大时，外植体在培养过程中只有轻微的失绿现象，且诱导出的毛状根长较粗壮。由于瞿麦毛状根比较纤细且毛状根有时会伸进培养基，在除菌2次左右时，外植体会变得比较脆，所以在除菌时应该用镊子小心夹取长出毛状根的外植体，避免破坏毛状根和外植体。

影响毛状根诱导效果的因素多种多样，如菌种类型、培养基类型、菌液OD值、侵染时间、侵染方式等。同一植物材料用不同的菌种侵染时，效果也不尽相同，每种植物外植体都有诱导率相对较高的菌种。如薛雯心等[16]用A4、C58C1和A14763菌株诱导党参毛状根发现，A4诱导率最高。然而，任如意等[17]用发根农杆菌A4、C58C1、R1601和ATCC15834菌株侵染毛酸浆外植体发现，4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根，其中ATCC15834的诱导率相对较高。培养基的类型不同，所含的成分也千差万别，不同的培养基类型为毛状根生长提供不同的营养物质，因此选择合适的培养基会更利于毛状根的生长。邹凯等[18]以发根农杆菌ACCC10060诱导甜叶菊毛状根，建立毛状根培养生产绿原酸类物质体系，结果表明，MS液体培养基较B5和WPM更利于甜叶菊毛状根生长及绿原酸类物质的积累。施和平等[19]用发根农杆菌ATCC 15834诱导美洲商陆毛状根时发现，在供试的MS、1/2MS、B5和6，7-V液体培养基中，以无外源激素的MS液体培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。针对外植体的生长状况选择合适的侵染时间是影响毛状根诱导率的一个关键因素之一。李素红等[20]在诱导决明毛状根的研究中发现，浸染时间在5 s至20 min随着浸染时间的延长，外植体的诱导率变化不显著，但平均每个诱导外植体的毛状根干重却在逐渐下降，浸染30 min，诱导率显著降低，平均每个诱导外植体的毛状根干重也显著降低。故决明毛状根培养的最佳浸染时间是5s，即浸湿后立刻取出。陈晨[21]对蚕豆外植体分别侵染5 min、10 min和15 min发现，侵染5 min与侵染10 min、15 min诱导率相差较大，而侵染10 min与15 min诱导率相差不大。刘连旺等[22]诱导地黄毛状根发现，侵染10 min时地黄毛状根的诱导效果最佳，之后随着侵染时间的增加，诱导率逐渐下降。对大多数的植物材料来说，一般最合适的侵染时间为8～15 min，一旦超过了最适侵染时间，随着侵染时间的延长，毛状根的诱导率反而会降低。A600的OD值对毛状根的诱导率也有极其重要的影响，宗晓秋[23]在诱导大豆毛状根的过程中发现，菌液A600OD为0.6时，毛状根的转化率最高，A600OD值为0～0.6时，毛状根的转化率与菌液A600OD值呈正相关，A600OD值为0.6～1.5时，二者呈负相关。林志豪等[24]在诱导黄瓜毛状根时发现，当OD600值小于0.8时，毛状根诱导率较低，为21.24%～57.69%；OD600值为1.2时，黄瓜毛状根诱导率大大提高，为70.83%。

综上所述，影响植物毛状根诱导的条件多种多样，相关科研工作者需通过不断探究找到不同材料诱导毛状根生长的最优条件。研究初步建立了瞿麦毛状根诱导和培养技术，后续还需对瞿麦毛状根的有效成分进一步研究。