响应面法优化车前草多糖超声工艺及抗氧化研究

邱曼榆　丘振文　谭汉添

摘要 [目的]通过响应面法优化车前草多糖的超声提取工艺，并评价其抗氧化能力。[方法]以车前草多糖（PLP）含量为评价指标，结合单因素试验和Box-Behnken响应面法对车前草多糖提取工艺进行优化，获取最优技术参数;此外，对车前草多糖进行·OH和O2·-清除能力的考察以对其抗氧化活性进行评价。[结果]车前草多糖最佳超声提取工艺条件为提取温度61 ℃、超声时间68  min、料液比1∶34，在此条件下，PLP含量可达12.25%±0.18%（n=3），与理论值仅相差0.12%;此外，当车前草多糖浓度为1 mg/mL时，其对O2·-和·OH的清除率分别为75.46%±0.54%和70.17%±0.94%。[结论]基于响应面法优化的车前草多糖超声提取工艺准确可行，可用于车前草多糖的提取;车前草多糖具有一定的抗氧化能力。

关键词 车前草;多糖;响应面法;超声提取工艺;抗氧化活性

中图分类号 R 284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）23-0214-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.055

Optimization of Ultrasonic Technology of Polysaccharide of Plantago asiatica by Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity Study

QIU Man-yu， QIU Zhen-wen， TAN Han-tian

（The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou，Guangdong 510405）

Abstract [Objective] To optimize the ultrasonic extraction process of polysaccharide of Plantago asiatica by response surface methodology and evaluate its antioxidant capacity. [Method] Taking the content of polysaccharide of Plantago asiatica as the evaluation index， combining single factor test and Box-Behnken response surface method to optimize the extraction process of Plantago asiatica polysaccharide to obtain the best technical parameters.In addition， the scavenging ability of Plantago asiatica polysaccharides on ·OH and O2·- free radicals was investigated to evaluate their antioxidant activity. [Result] The optimal ultrasonic extraction process conditions for polysaccharide of Plantago asiatica were： extraction temperature 61 ℃， ultrasonic time 68 min， and solid-liquid ratio 1∶34. Under this condition， the PLP content could reach 12.25% ± 0.18% （n = 3）， which was only 0.12% different from the theoretical value. In addition， when the polysaccharide of Plantago asiatica was 1 mg/mL， the removal rate of ·OH and O2·- free radicals were about 75.46%±0.54% and 70.17%±0.94%， respectively. [Conclusion] The ultrasonic extraction process of Plantago asiatica polysaccharide optimized based on response surface method is accurate and feasible， and can be used for the extraction of Plantago asiatica polysaccharide; Plantago asiatica polysaccharide has a certain antioxidant capacity.

Key words Plantago asiatica;Polysaccharide;Response surface method;Ultrasonic extraction process;Antioxidant activity

車前草是车前科植物车前（Plantago asiatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清热利尿通淋、祛痰、凉血、解毒之功效，用于治疗热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痰热咳嗽、吐血衄血、痈肿疮毒[1]。车前草全草主要含有黄酮类、多糖类及三萜类等多种化合物[2]。现代药理研究表明，车前草多糖（polysaccharide of Plantago asiatica，PLP）对高脂饮食和链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠具有治疗作用，其抗糖尿病作用可能与调节肠道菌群和增加SCFA水平有关[3]。此外，PLP还具有抗氧化和提高免疫力等药理作用[4-6]。然而，目前关于PLP提取工艺的研究较少。

响应面法由于具有优化时间短、应用可信度高等优点而越来越多地用于工艺优化研究中[7-9]，而基于响应面法优化PLP的超声提取工艺鲜见报道。为了更好地利用车前草的多糖资源，该研究在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计方案，研究各个因素之间对PLP提取率的影响，并作出响应面图，对超声法提取PLP工艺进行条件优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

UV-1900型双光束紫外可见分光光度计（日本岛津仪器有限公司）;TG16台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）;梅特勒LE204E万分之一电子天平（梅特勒-托利多国际有限公司）;车前草全草（广东康美药业有限公司，批号20190309）;D-无水葡萄糖对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B20966）。

1.2 试验方法

1.2.1 PLP含量的测定。

1.2.1.1

D-无水葡萄糖标准品的配制。精确称取10.05 mg葡萄糖对照品于100 mL容量瓶中，加入蒸馏水配制成0.100 5 mg/mL的对照品母液。

1.2.1.2 PLP溶液的制備。将车前草干燥后粉碎成粗粉，精密称取5.0 g粉末置于250 mL具塞锥形瓶中，加入蒸馏水适量，在规定的温度下超声设定的时间，分次于5 000 r/min离心20 min，获取上清液，上清液缓慢加入无水乙醇，搅拌，至混合液乙醇浓度为80%，4 ℃过夜，分次于5 000 r/min离心20 min，弃上清液。多糖沉淀加入100 mL蒸馏水复溶，即得PLP溶液。

1.2.1.3 标准曲线绘制。分别移取“1.2.1.1”对照品母液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL于比色管中，加水至2.0 mL;精密加入苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，在100 ℃水浴条件下静置20 min后，取出后立即置于冰水浴进行冷却处理，然后于490 nm处测定吸光度。空白对照为蒸馏水。绘制以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标的标准曲线。

1.2.1.4 方法学考察。方法学考察参考文献[10]进行操作，分别计算得精密度、重复性、12 h内稳定性的RSD。

1.2.1.5 PLP含量的测定。精密移取“1.2.1.2”中PLP溶液2 mL于5 mL容量瓶中，用蒸馏水补至刻度线并摇匀。精密吸取该稀释液2.0 mL，按照“1.2.1.3”自“加入苯酚溶液1.0 mL”开始同法操作，根据标准曲线法测定PLP含量。

1.2.2 PLP的提取工艺单因素考察。

1.2.2.1 提取温度对PLP含量的影响。在料液比、提取时间、提取功率分别为1∶20（g∶mL）、30 min、300 W的条件下，考察温度为30、40、50、60、70、80 ℃时对PLP含量的影响。

1.2.2.2 提取时间对PLP含量的影响。在料液比、提取温度、提取功率分别为1∶20、60 ℃、300 W的条件下，考察提取时间分别为30、40、50、60、70、80 min时对PLP含量的影响。

1.2.2.3 料液比对PLP含量的影响。在提取温度、提取时间、提取功率分别为60 ℃、60 min、300 W的条件下，考察料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45时对PLP含量的影响。

1.2.3 响应面试验。在单因素试验的基础上，参考Box-Behnken的试验设计原则，选取超声提取温度（X1）、提取时间（X2）和料液比（X3）3个影响因素，以PLP含量为考察指标，进行3因素3水平的响应面设计并根据试验结果作出响应面图，试验因素水平详见表1。并采用Design Expert 7.0数据处理软件对得到的数据进行分析。

1.2.4 PLP抗氧化功能研究。取1.0 mL浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的PLP样品溶液按照参考文献[11]方法进行PLP清除O2·-和·OH自由基能力的测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

按“1.2.1.3”方法操作，得到的标准曲线方程为Y=0.063 0X+0.029 0（r=0.999 7），表明葡萄糖浓度在0.634 3～12.680 0 μg/mL与吸光度具有良好的线性关系。

2.2 方法学考察

按“1.2.1.4”方法操作，计算得精密度RSD为2.45%，重复性RSD为2.67%，12 h内稳定性RSD为3.12%，表明该多糖含量测定方法准确、可靠，可作为后续测定不同工艺提取PLP含量的方法。

2.3 PLP的提取工艺单因素考察

2.3.1 提取温度对PLP含量的影响。由图1a可知，PLP含量在60 ℃时达到最大。因此，提取温度宜选在60 ℃左右。

2.2.2 提取时间对PLP含量的影响。由图1b可知，PLP含量的峰值出现在提取时间为60 min，因此，最终确定提取时间在60 min左右。

2.2.3 料液比对PLP含量的影响。由图1c可知，PLP在料液比为1∶35时提取含量最高，因此，料液比宜选取在1∶35左右。

2.4 响应面试验

按“1.2.3”方法操作，试验结果见表2。分析获得PLP含量（Y）回归方程为Y=-188.1+1.579 235X1+2.945 028 6X2+1.372 4X3-0.010 002X1X2 -0.005 00X1X3+0.003 01X2X3-0.007 01X12-0.017 99X22-0.011 89X32。经方差分析可知，该回归模型P值小于0.01，表明模型具有显著性，试验方法准确可靠;另外，方程失拟项远大于0.05，回归系数远大于0.9，充分表明模型具有较好的拟合度，与实测值相关度好。

为了确定影响PLP含量的最大因素，該研究基于回归方程再次使用Design-Expert 7.0软件绘制响应面图（图2）。由图2可知，各因素之间的响应面均较陡峭，说明各因素之间的交互作用均较强。根据所得到的模型，预测最优工艺条件为提取温度61.4 ℃、提取时间68.3 min、料液比为1∶34.3，在此条件下PLP含量理论上可达12.48%。根据实际情况，最终确定最佳工艺为提取温度61 ℃、提取时间68 min、料液比为1∶34，在此条件下，PLP含量可达12.25%±0.18%（n=3），与理论值仅相差0.12%，结果表明根据响应面法优化的PLP提取工艺准确可行。

2.5 PLP抗氧化功能研究

从图3可以看出，当浓度为1 mg/mL时，PLP对于O2·-和·OH的清除率分别为（75.46±

3 讨论

该单因素试验考察时，发现随着提取温度和料液比的增加，PLP含量均出现先增加后下降的趋势，表示在多糖提取过程中，温度过高（超过70 ℃）可能导致多糖的降解，这可能对于其他植物多糖的提取具有一定的指导意义。

多糖的研究和开发是目前的研究热点之一。目前文献对于车前草多糖的提取包括热水浸提法和微波提取法。热水浸提法提取效率较低，仅为7.4%[12]，而微波提取法为9.41%[13]，低于该试验条件下的12.25%，说明该研究基于响应面法的车前草多糖的超声提取工艺优化较为成功。然而，该试验条件下所提取的多糖为粗多糖，后续可通过对粗多糖进行脱色、除蛋白等各种纯化工艺获取精多糖，并对其进行结构鉴定，为后续开发利用车前草多糖资源奠定基础。

4 结论

该研究基于响应面法优化车前草多糖的最佳超声提取工艺条件为提取温度68 ℃、提取时间61 min、料液比为1∶34，在此条件下，PLP含量可达12.25%。该提取方法工艺稳定、操作简单、方法可行、结果可靠。另外，当车前草多糖浓度为1 mg/mL时，其对O2·-和·OH自由基的清除率分别为75.46%±0.54%和70.17%±0.94%，具有一定的抗氧化能力。

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作者简介 邱曼榆（1990—），女，广东普宁人，中药师，从事用药指导与监护工作。

收稿日期 2020-04-29