一株絮凝剂产生菌死谷芽孢杆菌Z11的筛选和鉴定

张晓飞, 孙云龙, 韩国红, 李刻秦 , 师晓喆, 胡加超, 董淑敏, 王 铮 , 赵 哲, 于 茹, 曲 杰, 宋 峰, 李正华*

1. 山东省生物物理重点实验室， 山东 德州 253023； 2. 德州学院生命科学学院， 山东 德州 253023； 3. 肥城市第三高级中学， 山东 泰安 217600

絮凝沉降法[1]在污水处理行业应用广泛，目前絮凝剂主要包括无机絮凝剂[2]、有机絮凝剂[3]及生物絮凝剂[4]，其中生物絮凝剂最为有效。生物絮凝剂因其来源广泛、安全高效、无二次污染等优点近年来逐渐成为研究热点。微生物絮凝剂是由微生物分泌的天然絮凝剂[5]，是絮凝微生物在生长过程中代谢产生的一种具有絮凝活性、高效、环保的新型水处理剂[6-9]。在重金属污水中加入絮凝剂产生菌[10,11]，将其分泌物提取纯化，可获得安全高效的天然降解剂，可用于除浊、脱脂，去除金属离子，促进污泥脱水[12]，并广泛应用于发酵、食品加工[13,14]和环保等领域。

近年来，国内外关于MBF方面的研究报道很多，上世纪70年代以来，美国、日本等其他国家非常重视对MBF的研究，20世纪美国科学家Butterfield首次从活性污泥中筛选出产絮凝剂菌株，近百种产絮凝剂菌株从土壤和活性污泥中筛选出[15]，包括真菌、细菌、放线菌和藻类[16,17]，其中最主要的有芽孢杆菌属(GenusBacillus)[18]、类芽孢杆菌(Bacteroides)[19]、假单胞菌(Pseudomonas)[20]等。但由于大多数絮凝剂絮凝活性较低[21]，且可工业化生产的MBF并不多，因此，MBF高产菌株一直是该领域的热点工作之一。

本研究从活性污泥中筛选分离出7株絮凝效果良好的菌株W7、Z9、Z11、X11、Z12、J9和Z18，选取絮凝效率最高的菌株Z11为研究对象。通过形态、生理生化特性和16S rRNA序列分析等，初步确定菌株Z11种属，并结合单因素试验及高岭土悬浊液为处理体系，研究菌株Z11的絮凝特性。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 样品：德州卓奥水质净化有限公司的活性污泥。

(2) 实验仪器：高压蒸汽灭菌锅，MLS-3750 日本三洋；超净工作台，JHT-DSC济南洁康净化设备厂；分析天平，PL203上海梅特勒；高速离心机，5418R德国Eppendorf；生化培养箱，QYC-200上海新苗；恒温摇床，ZWY-211C上海智诚；紫外分光光度计，TU-1900济南明智科学仪器有限公司；恒温鼓风干燥箱，WGL-125B天津市泰斯特仪器有限公司；生物显微镜，CX23 OLYMPUS奥林巴斯；PCR扩增仪，Thermo Arktik赛默飞。

(3) 培养基及试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等试剂，合肥博美生物科技有限责任公司；可溶性淀粉、硝酸钾、琼脂等试剂，上海博微生物科技有限公司；95%乙醇，结晶紫，过氧化氢溶液，番红，伊红，美蓝，路哥式碘液，吲哚试剂，甲基红染液等，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1絮凝剂产生菌的分离纯化

供试活性污泥采自德州卓奥水质净化有限公司，用无菌水稀释成浓度分别为(10-1～10-8)悬浊液，利用稀释涂布、平板划线法分离细菌单菌落，30 ℃培养24 h，观察单菌落长势及菌落特征。将纯菌种接种到LB液体培养基中，220 r/min 30 ℃恒温摇床振荡培养12 h，测定其对高岭土悬浊液的絮凝活性。

1.2.2絮凝活性的测定方法

以高岭土悬浊液为处理体系，向40 mL高岭土悬浊液(4 g/mL)中加2 mL1%的CaCl2和3 mL培养液的上清液，调pH为7.0，搅拌5 min，静置20 min，在550 nm处测定OD值，对照组为不加培养液的样品。测定各相同深度上清液OD值，与第一次絮凝相比，差值较小其稳定性好。计算絮凝率的方法如下:

絮凝率F(%)=(A0-A) /A0×100%

式中A0为空白对照组OD550;A为测试组样品OD550

选择其中絮凝率较高菌株，命名为菌株Z11。

1.3 菌株Z11菌种鉴定

1.3.1形态学观察

挑取少许单菌落接种至LB固体培养基，30 ℃培养24 h至菌落生长良好，观察菌落形态特征；在LB液体培养基中培养12 h后，观察试管中的菌体生长状况；选择生长良好的单菌落进行简单染色、革兰氏染色，观察细菌细胞形态，鉴别细菌的种类。

1.3.2生理生化实验

对菌株进行生理生化实验，依据《伯杰氏细菌分类手册》对菌种的生理生化特性进行鉴定。

1.3.316S rRNA 序列测序

(1) 细菌DNA抽提试剂盒快速提取菌株Z11基因组总DNA。

(2) 以细菌16S rRNA通用引物27F和1492R为扩增引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为25 μL，反应体系如下：0.5 μL样品DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，两种引物27F和1492R各1 μL (10 pmol)，10 μL ddH2O。

PCR扩增条件：94 ℃热启动3 min， 94 ℃变性30 sec循环30次，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃延伸5 min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μL PCR扩增产物，将产物纯化后测序，结果提交至NCBIGenBank，并与数据库中已有序列进行Blast比对，并通过MEGA进行序列分析，确定该菌株的分类地位。

1.4 菌株Z11絮凝特性研究

1.4.1温度对菌株Z11絮凝率的影响

在种子培养基中，分别在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃条件下220 r/min培养菌株，将培养基培养12 h的菌液取3 mL加入到高岭土悬浊液(4 g/mL)中，搅拌5 min后静置20 min。检测各组絮凝率，处理3组，取平均值。

1.4.2需氧量对菌株Z11絮凝率的影响

种子培养基初始pH调节到7.0，接种后分别在转速为100 r/min、150 r/min、200 r/min、220 r/min以及250 r/min，30 ℃条件下振荡培养12 h，取菌液3 mL加入到高岭土悬浊液(4 g/mL)中，搅拌5 min后静置20 min。检测各组絮凝率，处理3组，取平均值。

1.4.3pH对菌株Z11絮凝率的影响

取40 mL高岭土悬浊液(4 g/mL)于100 mL三角烧瓶中，分别加入2 mL1%的CaCl2，滴加盐酸、CaOH2溶液将烧杯中的液体pH分别调为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，每个烧杯加入3 mL菌株Z11培养液，搅拌5 min后静置20 min。吸取同一深度的上清液，以相同条件下不添加任何试剂的样品为对照组，测OD550，计算絮凝率，处理3组，取平均值。

1.4.4CaCl2添加量对絮凝率的影响

以400 mL高岭土悬浊液(4 g/mL)为处理体系，在500 mL烧杯中，分别加入浓度为1%的CaCl2溶液8 mL、14 mL、24 mL和32 mL，加入3 mL培养液，搅拌5 min后静置20 min。吸取同一深度的上清液，对照组为不加任何试剂的样品，相同条件下测上清液的吸光度OD550。测定絮凝率，处理3次，取平均值。

1.4.5菌株Z11培养液使用量对絮凝率的影响

以400 mL高岭土悬浊液(4 g/mL)为处理体系，在500 mL烧杯中，加2 mL 1%的CaCl2溶液，并向其他烧杯中分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 菌株Z11培养液，搅拌5 min，静置20 min。取同一深度的上清液，对照组为不加任何试剂的样品，测定其OD值，计算絮凝率，重复3组。

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选结果

经稀释涂布平板法与平板划线分离法，从德州卓奥水质净化有限公司的活性污泥中共筛选出158个单菌落，其中20株具有絮凝活性，以菌株Z12、J9、Z18、W7、Z9、Z11和X11的絮凝率效果较好，如表1所示，菌株Z11絮凝率最高，因此将其作为后续实验研究对象。

表1 各絮凝剂菌株絮凝活性

2.2 菌株Z11菌种鉴定结果

2.2.1菌落形态特征

菌株Z11的菌落在LB固体培养基上呈圆形、淡黄色、不透明状，其表面不光滑、有褶皱，菌落有粘性，易挑取。简单染色后观察菌株Z11菌体形状为直杆状，部分为弯曲状，且两端粗细差异不大(见图1)。

2.2.2生理生化鉴定

对菌株Z11进行生理生化分析，如表2该菌种为pH大于6.0，革兰氏阴性菌，代谢产生有机酸、气体、乙酰甲基甲醇和明胶酶，能够分解淀粉。根据《伯杰氏菌种鉴定手册》，初步鉴定为芽孢杆菌属(GenusBacillus)。

2.2.316S rRNA基因序列测序

采用16S rRNA通用引物(27F和1492R)扩增菌株Z11基因组总DNA，PCR产物经电泳检测后送至公司测序，结果提交至GenBank获得序列登入号KY049897。在数据库中进行Blast比对，结果显示Z11菌株16S rRNA基因序列与BacillusvallismortisIGSI-2 (MH744666.1) 相似性为 99%。分析其系统发育进化关系，结果显示Z11菌株与Bacillusvallismortis聚在同一分支(图2)。故初步鉴定为死谷芽孢杆菌属，命名为BacillusvallismortisZ11。

A

B

表2 菌株Z11的生理生化特性

2.3 絮凝特性研究结果

2.3.1温度对菌株Z11絮凝率的影响

温度对菌株Z11絮凝率的影响呈现倒“U”型(见图3)。在温度低于25 ℃时，絮凝效果随温度升高而增加，在25 ℃～35 ℃之间菌株生长状况较好，其中30 ℃时菌株生长率最高，絮凝率最高达到97.5%，之后温度进一步升高，絮凝效果变差。

注：括号内数值为GenBank登录号；分支上数字表示Bootstrap支持率；标尺刻度0.0002表示序列差异的分支长度。

图3 温度对菌株Z11絮凝效率的影响

2.3.2需氧量对菌株Z11絮凝率的影响

在一定转速范围内，菌株Z11絮凝率随着转速增加而提高，超过一定转速时，絮凝率保持稳定。当转速达到220 r/min时，菌株絮凝率最高，达到97.5%，说明在转速为220 r/min条件下菌株生长对氧的需求已经基本达到饱和(见图4)。

2.3.3不同pH对菌株絮凝率的影响

过酸或过碱均会影响微生物的代谢活性，从而影响微生物的絮凝效果，因此菌株在不同pH条件下产微生物絮凝剂的絮凝效果如图5所示，培养液受pH的影响，最佳pH范围为3.0～11.0，此范围内均有良好的絮凝效果，当pH为5.0时菌体代谢活性最高，对高岭土悬浊液的絮凝率为91.79%；当pH为3.0时菌株生长较弱，絮凝活性较低； pH大于5.0，随着pH的逐渐增加，菌株絮凝活性逐渐将低。所以在培养该培养液时，应控制pH在5.0附近，在过酸或过碱条件下不利与菌株生长。

图4 转速对菌株Z11絮凝效率的影响

图5 pH对菌株Z11絮凝效率的影响

2.3.4CaCl2添加量对菌株絮凝率的影响

二价金属离子能降低胶体分子间的排斥力，促进絮凝效果。由图6可知，Ca2+作为助凝剂，当CaCl2含量为24 g时，絮凝活性最高，对高岭土悬浊液的絮凝率达到91.60% ，CaCl2含量为40 g时，促进效果降低，对高岭土悬浊液的絮凝率为68.2%。因此，CaCl2最优添加量为24 g/L。

2.3.5菌株Z11培养液使用量对絮凝率的影响

培养液添加量不同对高岭土悬浊液的絮凝效果不同，如图7所示，培养液添加量为1 mL时，絮凝活性较好达到85.75%，当培养液不断增加时，絮凝活性在一定范围内随培养液的使用量增加而增加，当培养液添加达到3 mL～5 mL时，絮凝活性变化不明显，因此，每1 L高岭土及CaCl2悬浊液中菌株Z11培养液的最佳添加量为3 mL。

图6 CaCl2添加量对絮凝率的影响

图7 不同培养液使用量的絮凝活性

2.3.6最优条件下菌株Z11絮凝率

将菌株Z11在30 ℃、220 r/min条件下培养12 h，取3 mL添加到4 g/mL高岭土悬浊液和24 g/L 1%氯化钙溶液混合液中，调节pH为5.0，搅拌5 min后静置20 min。测定菌株Z11絮凝率，重复3次，取平均值(见表3)。

表3 菌株Z11絮凝率测定

3 结论

MBF在水处理中具有广阔的应用前景，对城市污水具有良好的絮凝活性。陈金发等[22]筛选鉴定出了一株路德维希肠杆菌，此菌株在最优条件下处理生活污水去除率可达72.2% 。GUO等[23]从活性污泥中筛选出MBF，在最优条件对畜禽废水的处理效率为87.9%。MBF在供水浊度和除菌效果等方面均优于有机和无机絮凝剂，且用量少，对人体无副作用。郭俊元等[24]以淀粉生产废水为原料制备MBF，将其应用于淀粉废水的处理，能够去除淀粉废水中72. 1%的浊度和47. 9%的COD。随着工业废水、生活污水以及畜业废水的产生和排放的不断增加，寻找出高絮凝效率的微生物菌株具有重要意义。

本研究从活性污泥中分离获得158株单菌落，对其进行絮凝活性检测，筛选鉴定得到7株絮凝活性较高的菌株。并对其中絮凝活性最高的菌株Z11培养条件进行优化并进行单因素实验，得到其在30 ℃、220 r/mn条件下培养菌液，菌株培养液添加量3 mL、pH 5.0条件下，对4 g/mL高岭土悬浊液和24 g/L 1%氯化钙溶液混合液的絮凝率最高为96.66%。昝继清等[25]筛选出的絮凝剂产生菌JX18，在最适培养条件下，对高岭土悬浊液的絮凝活性达到84%；李娜等[26]筛选分离得到菌株G1-3对高岭土悬浊液的絮凝率可达93.06%；武晓畅等[27]研究了培养条件对絮凝效果的影响，筛选鉴定出菌株PY-M3在最佳絮凝条件下絮凝率为96%。数据分析表明，在最优培养条件下，菌株BacillusvallismortisZ11的絮凝活性在已报道菌株中处于较高水平，以该菌株培养条件为基础，对其他死谷芽孢杆菌进行絮凝条件优化，从而为获得活性污泥高效处理菌株提供条件。

经形态、生理生化特性和16S rRNA序列分析，菌株Z11初步鉴定为死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)。通过对菌株BacillusvallismortisZ11的絮凝特性研究，分析絮凝菌株添加量、pH、Ca2+和温度等在培养过程对菌株的影响，为后续探究最佳发酵条件提供理论参考。由于发酵条件不成熟，絮凝效果不稳定，且培养费用较高等缺点，MBF还未得到广泛的应用和生产，因此对于影响絮凝剂产生菌生长代谢的因素还需开展更深入的研究。同时，寻找絮凝效果更加稳定的菌株，并优化菌株的培养条件，对MBF的工业生产具有重要意义。