黄河三角洲芦苇根际固氮微生物的空间分布特征

宋延静，马兰，李萌，付娆，梁晓艳，张海洋，王向誉，郭洪恩

(山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002)

微生物是全球生物地球化学循环的驱动者[1-2]，微生物介导的土壤氮循环对全球生态系统意义重大[3]，其中的固氮过程能够将大气中的氮气还原成氨和其他含氮化合物，为河口地区提供初级生产力。黄河三角洲是中国重要的后备土地资源，也是典型的河口湿地生态系统和生态敏感地带。在全球变化背景下，进一步揭示该地区微生物尤其是植物根际微生物驱动的氮循环过程，对评价与预测河口湿地生态系统服务功能与管理决策的变化至关重要。

芦苇作为能够在盐渍化环境下生存的典型常见盐生植物，主要生长在河口湿洼地和滨海沼泽地等地势低洼的地区。研究表明，芦苇在湿地系统的氮素降解过程中起着重要作用。YARWOOD等[4]对北美湿地地区的两类芦苇根际细菌和古菌群落结构进行研究，结果表明不同芦苇间芦苇根际细菌的丰度和群落结构不存在差异，而古菌的分布却存在显著性差异。LIU等[5]对北京翠湖湿地的芦苇根际古菌进行研究，发现其芦苇根际古菌主要来源于广古菌门和泉古菌门，同时还存在较多未知菌群。BORRUSO等[6]在对芦苇根际群落结构的调查中发现Desulfosalsimonas是内蒙古乌梁素海盐池内地区芦苇根际的主要微生物类群，同时发现盐度是影响此地区芦苇根际微生物群落结构的环境因子。总而言之，国内外有关芦苇根际微生物的研究主要集中于16S、18S基础之上的细菌、真菌研究[7-8]，而对根际功能微生物研究较少[9]，尤其是对黄河三角洲湿地芦苇根际固氮菌的研究。

结合荧光定量PCR技术与高通量测序技术，本研究首次对黄河三角洲不同地域的芦苇根际固氮微生物的丰度和群落结构进行比较分析，详细了解黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮菌分布的差异,不同生境下土壤理化性质与固氮菌群落结构和丰度相互关联的影响因素,旨在为理解盐渍化背景下土壤-微生物-植物互作机制提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 土壤样品采集

在黄河三角洲区域依次到昌邑、寿光、滨州、东营4个采样站(图1) 进行芦苇资源的调查及其芦苇根际土壤的采样。在采集根际土时首先要采集包含植物根系的土壤，对于质地松散的土壤，采用抖土法抖掉与根系松散结合的土壤，采用小刷将与根系紧密结合的土壤刷下来，作为根际土。采集后存于冰盒(4 ℃)并立即转移到实验室，用于提取DNA的样品后立即放置到-80 ℃冷冻，用于测定环境因子的样品放到-20 ℃。

图1 黄河三角洲地区采样点图

1.2 土壤理化性质测定

pH值的测定：土壤样品利用0.01 mol·L-1氯化钙溶液进行浸提。m(水)∶m(土)= 5∶1，经充分搅拌，平衡30 min，用pH值计测定。

土壤含盐量的测定：土壤样品利用0.01 mol·L-1氯化钙溶液进行浸提。m(水)∶m(土)= 5∶1，经充分搅拌，平衡 30 min，用电导率仪测定。

土壤中铵态氮、硝态氮、亚硝态氮含量测定：土样经冷冻干燥后，2.5 g 土中加入 25 mL 2 mol·L-1的KCl，振荡1 h，过滤备用，采用连续流动分析仪(AutoAnalyzer III)测定。

土壤总氮含量的测定：土样经冷冻干燥后过 100 目的筛子，用锡纸包样，利用元素分析仪(Vario Micro cube) 进行测定。

土壤中Na+和K+含量测定：称取5 g风干后土壤，加入25 mL去离子水，震荡过滤后利用原子吸收分光光度仪(岛津AA-7000)进行测定。

1.3 土壤DNA的提取和高通量测序

每个根际土壤样品称取0.5～1.0 g，利用Fast DNA®SPIN Kit for Soil (Bio 101，Carlsbad，CA)，按照试剂盒要求说明步骤提取土壤中微生物DNA。提取的 DNA 分装后用分光光度计(NanoDrop2000c)测定DNA 的浓度及纯度。利用固氮菌引物polF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′)/polR(5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′)[10]进行PCR扩增，然后利用Illumina PE250测序平台进行测序(上海凌恩生物有限公司)。

1.4 荧光定量PCR

固氮菌的绝对丰度采用TB Green荧光定量PCR法获得，在BioRad CFX96 平台上进行。反应体系(20μL)：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各 0.8 μL，样品模板 DNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。固氮菌荧光定量PCR的扩增引物为反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；最后按照BioRad CFX96实时荧光定量检测系统默认程序制备熔解曲线：95 ℃ 5 s，65 ℃至95 ℃(每个循环增加0.5 ℃)5 s，检测是否存在非特异性扩增。稀释相应的质粒浓度从10-1到10-8，并最终绘制标准曲线。每个样品设3次重复，并设不加模板的反应管为阴性对照。

1.5 高通量数据分析

高通量数据分析基于Linux 平台的QIIME 1.9.0 流程，参考数据库为FGR(version:7.3)。具体流程如下：过滤read尾部质量值20以下的碱基和质控后50 bp以下的read；筛除错配比率大于0.2的拼接序列；用Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体，并选取97%的序列相似度作为阈值(cut off)划分 OTU；采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。

1.6 数据处理

利用 SPSS 20 统计软件中的单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)检验不同地域芦苇根际土中nifH基因拷贝数的差异是否显著；利用mothur计算不同地域芦苇根际固氮菌的α多样性指数；利用R语言的vegan包进行基于UniFrac的聚类树分析，应用CANOCO软件中的典型对应分析(CCA)探索固氮菌群落结构与环境变量之间的关系。

2 结果与分析

2.1 土壤环境因子分析

表1 环境因子测定结果

2.2 固氮菌丰度比较及与环境因子相关性

定量PCR结果(图2)显示，来源于黄河三角洲4个采样点的芦苇根际土壤中nifH基因拷贝数存在显著差异(P<0.001)，其中东营地区芦苇根际土中nifH基因拷贝数平均值为1.31×108copies·g-1；滨州地区芦苇根际土中nifH基因拷贝数平均值为9.47×107copies·g-1；寿光地区芦苇根际土中nifH基因拷贝数平均值为1.59×106copies·g-1，昌邑地区芦苇根际土中nifH基因拷贝数平均值为2.39×106copies·g-1，具体表现为东营>滨州>昌邑>寿光。与根际土相比，芦苇根周土中的固氮菌丰度在昌邑、寿光、东营3个采样带差异不显著，只有来源于滨州采样点的芦苇根际土中nifH基因拷贝数显著高于根周土(5.64×107copies·g-1，P=0.006)。

利用SPSS软件对芦苇根际固氮菌丰度与环境因子进行Pearson相关性分析，发现芦苇根际固氮菌丰度与土壤含盐量(ρ=0.964，P=0.036)和含水量显著正相关(ρ=0.986，P=0.014)，与其他环境因子相关性不显著。

2.3 黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮菌的α多样性

通过质控，共获得169 582 条高质量的nifH基因序列，划分为1 577个OTU， 每个采样点芦苇根际固氮菌的OTU数量平均在279～839之间，固氮菌的α多样性指数(OTU 数目、丰富度指数Chao1、多样性香农指数和辛普森指数)在滨州采样点最高，昌邑采样点最低。从表2的Chao数据可知，各样本的微生物丰富度排序为：滨州>东营>寿光>昌邑；从Shannon 指数来看，各站点微生物多样性从高到低依次是：滨州>东营>寿光>昌邑。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 不同采样点芦苇根际固氮微生物α多样性指数

2.4 黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮微生物群落组成分析

从图3中门的水平来看，所有芦苇根际固氮菌中，变形杆菌门(Proteobacteria)占据绝对优势(54.4%～86.0%)，只是不同采样点的类型不同。其中在滨州采样点的芦苇根际中，γ-型变形菌纲(29.3%)丰度最高，同时也存在δ-变形菌纲(19.6%)，β-变形菌纲(14.0%)和α- 变形菌纲(10.7%)；昌邑采样点的芦苇根际土中，α-变形菌纲(49.7%)和β-变形菌纲(20.0%)占主导；东营芦苇根际土中，δ-变形菌纲(33.6%)和γ-型变形菌纲(32.6%)丰度最高；寿光芦苇根际土中，主要的固氮菌类型为α-变形菌纲(27.1%)和β-变形菌纲(19.0%)，但变形菌门不是寿光芦苇根际土中的核心类群，蓝细菌门是寿光芦苇根际的主要固氮菌类群(Cyanobacteria，30.8%)。除蓝细菌外，放线菌门(Actinobacteria)也仅在寿光的采样点含量较丰富。厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、绿菌门(Chlorobi)在滨州的芦苇根际丰度较高。广古菌门(Euryarchaeota)在东营、滨州采样点丰度要显著高于昌邑、寿光。

从图4属的水平可以看出，滨州采样点芦苇根际固氮菌中占优势的菌属分别为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium，9.28%)、脱磷孤菌属(Desulfovibrio，9.00%)以及固氮弧菌属(Azoarcus，10.6%)，昌邑芦苇根际固氮菌占优势的菌属为农杆菌属(Agrobacterium，32.7%)，东营芦苇根际固氮菌占优势的菌属为慢生根瘤菌属(16.1%)，寿光采样点芦苇根际固氮菌占优势的菌属为固氮螺菌属(Azospirillum，18.8%)以及鱼腥藻属(Anabaena，17.9%)，其中鱼腥藻属仅在寿光、昌邑芦苇根际有发现。

图3 黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮菌群落热图(门级别)

2.5 芦苇根际固氮微生物在黄河三角洲的空间分布差异及环境影响因子

由图5可看出，黄河三角洲芦苇根际固氮菌群被分为4大分支，第一分支包含第二分支和寿光芦苇根际，第二分支包含第三分支和昌邑芦苇，第三分支包含东营芦苇和滨州芦苇。结合样本在树状图中的位置以及树状图中树枝长度可知，东营和滨州芦苇根际固氮菌群落组成以及结构差异较小，寿光芦苇根际固氮菌群落结构与其他样本的差异性较大。

典型对应分析(CCA,图6)发现黄河三角洲区域芦苇根际固氮菌的群落结构受总氮(P=0.05)、含水量(P=0.08)、Na+含量(P=0.16)的影响较大。第一轴解释率为47.2%,第二轴解释率为36.6%。

3 结论与讨论

3.1 黄河三角洲不同地区芦苇生境特征

芦苇是黄河三角洲地区常见的一种盐生植物，在昌邑、寿光、东营、滨州等盐渍化地区均有分布[11]。对4个采样点的土壤分析结果显示，4个采样点pH值相近，都属于弱碱性土壤，肥力较低，无机氮(氨氮、硝态氮和亚硝态氮总和)含量在2.78到14.05 mg·kg-1之间，远远低于耕地的氮水平[12-13]。东营和滨州采样点的盐渍化程度最高，且均为黏土。寿光和昌邑采样点土壤属砂质土，虽然属于滨海盐土范畴，但含盐量不高。滨州、寿光地区的总碳、总氮含量均高于昌邑、寿光采样点，土壤营养成分相对较高。

图4 黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮菌群落结构(属级别)

图5 基于UniFrac的芦苇根际固氮菌聚类树分析

3.2 芦苇根际固氮菌在黄河三角洲不同地区的空间分布特征

本研究发现，黄河三角洲地区芦苇根际固氮菌的丰度存在空间分布差异，东营、滨州两个采样点的芦苇根际固氮菌丰度显著高于昌邑、寿光。在黄河三角洲不同地区的芦苇根际中，变形杆菌门(Proteobacteria)始终占据绝对优势(54.4%～86.0%)，分析黄河三角洲湿地土壤pH值为7.18～7.58，说明变形杆菌门、蓝菌门、厚壁菌门在该pH范围内可以生长，而变形杆菌成为黄河三角洲湿地中主要固氮微生物的原因可能与其对盐碱地的适应性更强有关。脱磷孤菌属(Desulfovibrio)是滨州芦苇根际的优势菌株，此类群也被兰鸿珠等研究为艾比湖湿地地区芦苇非根际土壤土壤中的优势固氮类群[14]，脱硫孤菌属是一种主要分布在淡水、淡咸水、海水的沉积物中的革兰氏阴性菌，属于硫酸盐还原菌，有科研人员从潮间带微生物席上也得到该硫酸盐还原细菌菌株[15]，这可能跟滨州芦苇所处土壤环境含水量较高有关。固氮螺菌属(Azospirillum)和鱼腥藻属(Anabaena)是寿光地区芦苇根际的主要固氮菌类群，寿光地区固氮螺菌属是一种具有固氮作用的根际联合固氮菌[16]。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)是东营和滨州两地芦苇根际的优势菌属。

黄河三角洲不同地区芦苇根际土中鉴定出很多尚未培养或未知种属的固氮菌，揭示了芦苇根际固氮菌多样性及种类的庞大。多样性与其生态稳定性密切相关，黄河三角洲滨海湿地生境中芦苇根际固氮菌的多样性一定程度上表明芦苇的生态适应性以及较为完整的系统结构。总体来讲，黄河三角洲不同采样点下芦苇根际土壤中的微生物群落在门水平上有一定的稳定性，其核心微生物群落结构只是在含量上发生改变．通过β多样性分析滨州和东营间细菌群落组成以及结构差异较小，寿光与其他样本的差异性较大。研究表明地理距离是影响细菌群落分布的重要因素[17]，本研究与此结论一致。

图6 黄河三角洲不同地区芦苇根际固氮菌群落结与环境因子的典型对应分析

3.3 黄河三角洲芦苇根际固氮菌丰度、群落结构的环境响应

由于固氮菌在土壤氮循环功能中占有重要位置，对滨海湿地盐生植物根际固氮菌多样性及分布规律的认识有助于进一步理解此环境氮循环的微生物学机制。本研究结果说明固氮菌在黄河三角洲芦苇根际广泛存在，多样性较高；不同地区的芦苇根际固氮菌丰度和群落结构分布存在差异，总氮、含水量、含盐量等环境因子是调控黄河三角洲地区芦苇根际固氮菌群落结构和丰度的最重要环境因子。接下来可从时间、生态位的跨度方面对黄河三角洲芦苇根际固氮菌的群落分布进行进一步研究。