血液净化清除蛋白结合毒素的研究进展

古晓燕 综述 龚德华 审校

尿毒症毒素可分为小分子水溶性化合物、中分子毒素和蛋白结合毒素(protein bound uremic toxins，PBUTs)三大类。PBUTs多为肠道细菌分解食物蛋白质的产物，其与白蛋白(分子质量68 000 D)结合后成为大分子质量毒素，不易被常规血液透析(hemodialysis,HD)清除，因此被称为蛋白结合毒素。常见的蛋白结合毒素有硫酸吲哚酚(indoxyl sulphate,IS)和硫酸对甲酚(p-cresyl sulphate,PCS)、马尿酸(hippuric acid,HA)等。IS和PCS研究较多且有代表性，两者的蛋白质结合率分别为97% 和95%[1]，相对分子质量分别为212 D和187 D。在健康肾脏中PBUTs的清除很大程度依赖于肾小管分泌，而常规HD主要模拟肾脏的滤过功能，只能清除游离的毒素部分，因此增加PBUTs吸附和增加游离分数可提高清除率。吸附是清除PBUTs的主要方式，同时增加PBUTs的解离和改变透析参数，也可以增加其清除。本文拟就血液净化清除PBUTs的研究进展进行简述。

PBUTs的清除机制及其对机体影响

正常肾脏中PBUTs主要在肾小管清除。游离和蛋白质结合的PBUTs被输送到肾脏，游离的PBUTs从肾小管周围毛细血管经由基底外侧膜上的有机阴离子转运体分泌到近端小管细胞，然后通过顶膜上的膜基蛋白从近端小管细胞转运到小管腔内，近端肾小管细胞内部的电位比管腔低，这一途径由电驱动，最后从尿液中排出。肾小管功能受损时， PBUTs在血液蓄积[2]，而常规HD只能模拟肾小球的滤过功能，与蛋白后结合的毒素分子质量大，清除效果较差。研究表明，传统的低通量HD不能清除色氨酸相关PBUTs[3]；与年龄匹配的健康对照组相比，HD患者IS和PCS水平分别高116倍和41倍，而尿素和肌酐的浓度分别仅高5倍和13倍[4]。

PBUTs潴留会对机体产生很多影响。Shafi等[5]研究发现血清白蛋白水平越低的患者，PCS、IS水平越高，发生心源性死亡和心源性猝死的风险越高。Sun等[6]以B-6小鼠半肾切除的小鼠和体外培养的人肾小管上皮细胞为研究对象，发现IS和PCS在体内和体外均损害有氧和无氧代谢，与慢性肾脏病(CKD)及其并发症有关。除氧化应激外，PBUTs还引起炎症反应并激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，增加肾纤维化[7]，同时还和血管钙化和动脉粥样硬化[8]、认知功能下降[9]、残余肾功能下降[10]、凝血功能异常[11]相关，甚至PBUTs血清浓度升高直接与心血管、肾脏疾病的进展及肾脏病患者的高死亡率相关[12]。

增加PBUTs血液净化清除的方法

新型吸附材料吸附是清除蛋白结合毒素的重要的方式，新型吸附材料的研究、制备、验证是目前的热点。Meyer等[13]从模型研究中预测，吸附可以增加PBUTs清除的驱动力，提高清除率。Pavlenko等[14]研究开发了集透析和吸附于一体的新一代混合基质膜(mixed matrix membranes,MMMs)，与第一代MMMs以及商用透析膜相比，它具有更小的直径和优化的特性，研发的M6膜对IS和PCS的清除率分别为367 mg/m2和380 mg/m2，能更好地去除IS和PCS。IS和PCS的游离部分通过内选择膜层，迅速被外层内的颗粒吸附，增加了PBUTs的浓度梯度，并刺激游离部分的毒素从蛋白质释放至血浆，从而清除率更高。Geremia等[15]通过干湿法纺丝技术制备了含有活性炭颗粒的双层中空纤维混合基质膜，既不降低活性炭吸附能力，又同时完全去除透析液中的内毒素以及高效去除血浆中的尿毒症毒素。MMMs是由聚醚砜(polyethersulfone,PES)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)共混物组成的内选择层和嵌在PES/PVP基体中的活性炭微粒组成的外层组成的双层中空纤维膜，具有同时结合弥散和对流以及AC颗粒的吸附能力。内部无颗粒层避免了AC与患者血液的直接接触，有较好的血液相容性。只需要0.15 m2的MMMs即可完全除去与每日产量相当吲哚硫酸盐和HA，同时应用在可穿戴人工肾装置中可去除内毒素。Fu等[16]用活性炭、ZSM-5沸石和氧化石墨烯为吸附剂，采用非溶剂诱导相转化法制备了多孔PES混合基膜，同时提出制备多孔膜的最佳条件，以提高PCS和IS高清除率的同时还保证足够的机械强度，延长溶液与膜基体的接触，且PES膜有一定的亲水性，同时体外细胞验证混合基质膜对成纤维细胞的细胞活性和血液相容性均无明显影响。Yamamoto等[17]研究了活性炭通过体外直接血液灌流吸附循环PBUTs的效果，活性炭可剂量依赖性降低血液中PBUTs水平，并在体外有效吸附血液中的PBUTs。活性炭血液灌流可清除患者血液中的PBUTs，可能是一种很有前景的治疗策略。Sternkopf等[18]以多孔活性炭为芯材，亲水性聚乙烯吡咯烷酮为表面涂层，制备了一种双功能体外全血吸附器颗粒，该颗粒对疏水性、蛋白质结合的尿毒症毒素具有很高的吸附能力，对白蛋白结合或血液相容性无不良影响，对 CKD 5期患者血液中的疏水性、蛋白结合性毒性具有很高的清除率。这种方法产生了一种对疏水性尿毒症毒素具有很高吸附能力的血液相容性吸附器。目前很多新型吸附材料体都提高了PBUTs的清除率，有望降低CKD患者的发病率和死亡率。

有机金属也可用于清除PBUTs。Kato等[19]发现9种基于锆的金属有机骨架(metal-organic frameworks,MOF)对PCS、IS和HA等PBUTs具有吸附作用。NU-1000是一种基于苯并芘的金属有机框架，在所有金属有机框架中对PBUTs清除效率最高，NU-1000的高吸附容量可归因于被两个芘连接体和Zr6节点上的羟基和水分子夹在中间的高度疏水的吸附位，这些吸附位能够与配体分子的极性官能团发生氢键作用。NU-1000几乎可以完全去除人血清白蛋白结合的PCS。

体外肝脏支持吸附透析装置，即血浆分离、吸附和透析(fractionated plasma separation,adsorption,and dialysis,FPAD)系统，其清除蛋白结合的疏水性尿毒症毒素的效能优于传统的高通量HD[20]。Sternkopf等[18]发现与传统的高通量HD相比，FPAD治疗5h显著增加疏水性尿毒症毒素的清除，苯乙酸、PCS和IS清除率分别增加130%、127%和187%。但FPAD成本高，难以常规开展。

增加PBUTs游离分数常规HD中PBUTs清除率低，主要与其结合白蛋白后分子量大、游离分数低有关。增加PBUTs的游离分数可增加清除率，目前可以通过电离或者竞争剂与其竞争结合白蛋白位点增加其游离分数。

增加血液中PBUTs的电离度可提高游离分数。Yen等[21]采用静电纺丝法制备了导电的四元复合纳米纤维垫，碳纳米管/导电聚合物杂化纳米纤维，将碳纳米管结合到传统的PES透析膜上，实现了PBUTs电解离，这种系统的透析设备可增加PBUTs清除的同时将蛋白质损失降至最低，并且耐水性良好，有良好的抗凝能力，还可降低的补体激活，减少血小板吸附，并且很少产生红细胞溶血。它们在开发生物电子药物具有潜在前景。

竞争结合白蛋白位点同样可以增加PBUTs游离，从而提高清除率。白蛋白结合配体可通过直接竞争结合位点或通过变构机制影响白蛋白与其他配体的结合，特定配体与白蛋白的结合可能改变结合位点附近的构象。使用具有与PBUTs相同结合位点的化合物来阻止其结合是增加这些尿毒症毒素的游离分数的直接方法。竞争剂必须安全、有效，不仅能够竞争白蛋白上的毒素结合位点，还需有较短的半衰期，能被肾脏以外的器官清除，同样重要的是要避免竞争剂导致具有相同白蛋白结合位点的自身有益物质的损失。Tao等[22]进行体外和离体研究表明，布洛芬可与白蛋白的Sudlow位点2结合，而IS和PCS被布洛芬取代，通过体外输注PBUTs结合竞争物质，可以显著提高PBUTs的透析清除率。同样地，Madero等[23]研究在常规HD中，通过向体外循环注入布洛芬，可以有效且可逆地将IS和PCS从它们的白蛋白结合位点置换出来，显著增加IS和PCS清除率，透析后IS和PCS血清水平显著下降。Maheshwari等[24]在计算机上比较HD、血液透析滤过(hemodiafiltration,HDF)、膜吸附和结合竞争去除PBUTs之间的差异，在透析中使用了PBUTs/置换器动力学的数学模型，该模型包括一个三室患者模型，一个动脉/静脉管段模型和一个透析器模型，模型表明HD体外回路中的结合竞争比传统的HD，HDF和膜吸附大大提高了PBUTs的清除，最终显示竞争性结合是提高PBUT清除率的实用方法[24]。

改变透析参数

增加透析时间和频率 由于PBUTs的蛋白结合率高，而常规HD只能清除游离部分，因此提高频率和透析时长可能会提高其清除率。Eloot等[25]建立数学动力模型研究发现，PBUTs的清除模式与其他尿毒症毒素明显不同，对于蛋白结合率高的PBUTs，透析充分性主要取决于每周处理血液量，而这由透析频率和透析时间决定。对于固定类型的透析器，无论是延长透析时间还是频繁透析，在保持与标准透析相同的处理血量的情况下，对于高蛋白结合的化合物来说，只会导致有限的溶质浓度下降。同样的，Sirich等[26]研究发现在高频HD网络(FHN)中随着透析频率和时间的增加，尿毒素溶质浓度的降低的增幅较小。每周接受6次(平均14.6 h/周)治疗的FHN患者溶质的平均浓度仅比接受每周3次常规治疗(平均10.9 h/周)的受试者平均浓度低15%，定量测量证实，IS和PCS的浓度并没有显著降低，溶质浓度相对于提高透析时间和频率的工作量而言，没有下降到预期的程度。Maheshwari等[27]建立了一个综合的PBUTs动力学模型，显示增加透析液的流速可以提高PCS和IS的清除率，然而随着透析器性能的提高，PCS和IS的清除率增幅有限，考虑清除动力是由血浆和透析液之间游离毒素浓度差驱动的，PBUTs导致的较小扩散梯度是清除率的限制因素。由此可得，提高透析的频率、时间和透析液的流量对于PBUTs的清除率提升效果较工作量而言性价比不高。

提高透析液流速 Meyer等[28]建立了高蛋白结合率的PBUTs的动力学模型，PBUTs的透析清除表达式是由游离毒素分数决定，他们预测增加透析液流量并伴随透析器表面积的增加将改善PBUTs的清除。然而有研究表明，增加了透析器的大小以及血液和透析液的流量，对PCS和IS血浆浓度水平的影响很小[29]。

调整透析液成分 Nerusu等[30]研究人血清白蛋白结构域，发现PBUTs均可与白蛋白结构域D2、D3和D2-3相互作用，亲和力显著，与其他结构域相比，D3亲和力较高。人血清白蛋白结构域的解离常数(Kd值)与完全人血清白蛋白的Kd值有显著差异。Kd值决定了配体的游离态和蛋白质结合态浓度。提高透析液对PBUTs的亲和力和特异性可以提高透析液的效率，透析液对PBUTs的特异性可以通过使用两个结构域(即D2和D3)的组合作为透析液并通过调整D2和D3的比例来实现。

改变透析方式 目前的常规的HD方式原理多为弥散和对流，而PBUTs分子量大限制了其清除，不同透析方式对PBUTs清除率差异不大。Maheshwari等[24]发现与常规HD相比，HDF仅稍增加PBUTs的清除。van Gelde等[31]研究发现与低通量HD相比，HDF治疗6个月仅降低了IS的血浆浓度，而PCS、HA浓度无显著改变。膜的孔径及其超滤系数对与白蛋白结合的PBUTs的清除率几乎没有影响[32]。

降低PBUTs的其他方法

减少PBUTs产生通过肠道干预可控制尿毒素产物在肠道的产生和吸收，Chen等[33]对八项研究的系统回顾发现，口服含碳吸附剂AST120可有效降低IS血清水平，但在减缓疾病进展和全因死亡率方面仍存在争议。

保护残余肾功能PBUTs分子量很大，正常多不能经过肾小球滤过，主要以肾小管分泌方式清除[34]。Leong等[35]发现了有残余功能每周两次透析的患者的HA、苯乙酰谷氨酰胺、IS和PCS浓度，并不显著高于无尿每周三次透析的患者，前组患者血浆HA和苯乙酰谷氨酰胺的水平低于后组患者，由此可知残余肾功能可有助于减少尿毒症毒素的积累，对于经肾小管分泌清除的毒素可能尤为重要，这种功能不能被HD模拟。van Gelde等[31]研究发现，残余肾功能与犬尿酸(P<0.001)、吲哚硫酸盐(P=0.001)、吲哚-3-乙酸(P=0.024)、对甲酚葡萄糖醛酸(P=0.004)和HA(P<0.001)血浆浓度呈负相关。故保护HD患者残余肾功能对减少PBUTs血浆浓度起重要作用。

小结:PBUTs对心血管和肾脏具有多种危害， 降低PBUTs对减少CKD患者并发症以及提高其生存率具有重要意义。提高血液净化对PBUTs的清除能力是目前的研究热点，尤其是新型吸附材料的研制及开发，仍需深入开展相关临床研究。