TB/HIV患者血浆蛋白组织学研究进展

哈斯来提阿依·买买提，胡昕，齐曼古力·吾守尔

（新疆医科大学第一附属医院呼吸科，新疆 乌鲁木齐）

0 引言

结核病（tuberculosis，简称TB）是由结核分枝杆菌[1]（Mycobacterium tuberculosis，MTB,俗称结核杆菌）感染引起的严重危害人类身心健康的呼吸道传染性疾病。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据显示[2]，2017年全球潜伏结核感染者17亿，其中新发病例1000万，死亡例数130万。我国新发病例数88.9万，占全球新发病例8.89%，仅次于印度尼西亚（2740万例），排列第二。其中结核病合并艾滋病双重感染人群达90万，死亡例数30万，占全球结核死亡例数23.08%。艾滋病是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV)侵入人体后攻击和杀伤免疫细胞，破坏机体免疫系统功能而引起的获得性自身免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）。机体免疫缺陷、免疫系统功能破坏常增加机会性感染风险，其中结核病（tuberculosis，TB）最常见，是正常人群30倍[3]。据文献报到[4]，1/8新发结核病患者发生在HIV阳性者中。HIV阳性者中潜伏性结核杆菌感染者发展成活动性肺结核可能性比HIV阴性者高20-30倍。TB/HIV双重感染患者因免疫力极度低下、临床症状不典型、各项辅助检查阳性率低、早期发现及诊断困难，导致疾病疫情居高不下。对于TB/HIV双重感染患者，现有的防治规划难以满足大量患者的需要，实际需求与诊治方案不相适应，这就迫使医疗尽快拿出一套针对特殊结核病（TB/HIV）人群行其有效的结核病防治策略。

1 血浆蛋白组织学概述

随着生物技术的发展，研究者们将TB诊断的重点开始转向能反映机体状态的蛋白质组学研究。1991年Nagai等[5],首次应用双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术，对MTB H37Rv菌株2—10周培养滤液中的蛋白质进行分离鉴定，拉开MTB蛋白质组学研究的序幕。

血浆蛋白组学本质上是指在大规模水平上研究血浆中蛋白质特征的一门学科。当机体受刺激或生理功能发生变化时，血清蛋白也随着出现相应变化。经研究发现，含量少于1%的低分子量蛋白质分子（分子量小于10ku）是与疾病相关的组织病理信息载体，疾病时释放到血液循环中。血清蛋白质组学作为一种整体、动态、定性、定量、全面分析蛋白质功能、组成以及相互关系的一门学科，发现疾病相关的血清蛋白标志物有重大意义。蛋白质组学技术是指使不同水平的蛋白质能够同时分离和鉴定的技术。包括蛋白质分离技术，如iTRAQ技术[6]及非标记技术[7]。蛋白质鉴定技术，如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱[8]（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，电喷雾串联质谱[9](electrospray tandem mass spectrometry，ESI-Ms/Ms)技术等。其中，iTRAQ-2DLC-MS/MS技术因分离能力强、分析范围广、灵敏度高、特异性高、检测限低、自动化程度高等诸多优点，受研究人员关注并广泛使用。因血浆蛋白组学以上特点，目前越来越研究者将开始运用血清蛋白组织学技术来寻求疾病与之相关靶蛋白关系，为疾病早期发现、诊断提供充足的诊断依据。目前国内外研究者利用不同蛋白组织学技术探索研究宫颈癌[10]、口腔鳞状细胞癌[11]、肝细胞癌[12]、急性淋巴细胞白血病[13]等多种疾病的生物标志物。

2 血浆蛋白组学在疾病中应用

2.1 血浆蛋白组织学在不同结核病中应用

Jiang等[6]，选取136名肺结核患者及66名健康人群血清标本,进行脱盐、浓缩、还原、消化等处理，iTRAQ同位素标记联合2DLC-MS/MS技术对样本进行分析。最终在TB和健康组中获得79种差异蛋白（51种上调蛋白，28个下调蛋白）。这些蛋白质功能多样，参与机体生物调节、细胞代谢、参与补体凝血连锁通路、感受器相互作用等功能。综合考虑倍数变化率，蛋白功能等因素，最终选维生素K依赖蛋白Z（Human vitamin K-dependent protein Z ，PROZ),淀粉样蛋白A（Serum Amyloid protein A，SAA）和C4b结合蛋白β链（Human C4b-binding protein beta chain，C4BPB），用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbet assay,ELISA)法对差异蛋白行后续验证，构建含有验证蛋白质的TB决策树。得出该诊断模型准确率97.2%，敏感性97.06%，特异性95.45%。因此，认为SAA，PROZ和C4BPB可能是肺结核的新型潜在诊断性生物标志物。Xu等[14]，将TB患者及健康人血清进行iTRAQ-2DLC-MS/MS分析比较,获得载脂蛋白II（Apolipoprotein II，APOCII)、人CD5分 子 样 蛋 白(Human CD5 molecular protein，CD5L)、重组人视黄醇结合蛋白（Recombinant human retinol binding protein，RBP4)含量在TB患者血清中显著升高。以蛋白质构成最优分类树诊断模型，该模型筛检敏感度、特异度分别为93.42%，92.86%，对于区分TB与健康人有价值。Wang等[15]，运用 iTRAQ-2DLC-MS/MS技术研究MDR-TB患者血清中 CD44、激肽原1重组蛋白（Recombinant Kininogen 1,KNG1）等蛋白含量与健康人群相比明显升高，可作为潜在的MDR-TB诊断标志物。胡水秀等[16]，用采用同位素标记结合MALD-TOF/MS技术筛选涂阴结核患者血浆蛋白组织学监测，共发现18中差异表达蛋白。Wang等[17]，对规律抗结核治疗后患者及健康对照组血清进行分析，最终发现白蛋白,解离抑制因子β,补体C3,纤维黏胶蛋白2，脂蛋白a水平较健康人群中显著升高，建立其诊断模型,灵敏度87.1%,特异度79.49%,且准确度为87.6%。认为这五种蛋白可能是治疗后结核病患者血清蛋白标志物。Liu等[18]，将该技术与弱阳离子交换磁珠相结合，对痰涂阴肺结核患者和健康人血清进行检测，发现3个具有显著性差异的蛋白峰，峰值分别为2747、4480、9410。以此建立分析模型对诊断涂阴肺结核患者的灵敏度83.33%,特异度82.50%。

2.2 血浆蛋白组学在TB/HIV双重感染人群中应用：

Chen 等[19]，对TB/HIV与单纯HIV两组人群血清应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术进行分析，发现25中表达差异蛋白。其中，7种蛋白表达下调，18种蛋白表达上调。并对差异表达蛋白用ELISA法验证，最终发现内皮糖蛋白（ENG）重组蛋白在双感患者血浆中表达上升至10倍以上。认为ENG蛋白是结核合并艾滋病患者特意血浆蛋白标志物。

3 结论

结核病是是艾滋病毒携带者的头号杀手。艾滋病病毒通过扩大潜伏结核重新激活的风险、增加一旦感染结核杆菌再次发生结核感染的可能性以及提高感染后立即迅速进展的危险，极大地重塑了结核的流行病学。MTB感染可加剧HIV感染的病程。有报道指出，机体感染MTB后可诱导疾病相关细胞因子的释放，这些因子可增加HIV的复制。HIV合并结核杆菌感染促进彼此进展，加快机体免疫功能下降速度。两者合并可产生“1+1＞2”的严重后果。HIV/TB 临床症状及影像学表现特征不典型、实验室检查结果阳性率低，故早期诊断较困难。

蛋白组学研究已有上百年历史，发展至今已日趋成熟，它是对整个基因组在不同时空编码的全部蛋白质的组成和活动规律的研究，并在组织细胞的整体蛋白质水平上揭示生命活动的基本规律，获得对细胞生理、病理过程及调控网络的全面、深入的认识。近几年，随着生物技术的发展，越来越多的学者试图寻求快速、准确的结核病诊断方法。经血浆蛋白质组学技术发现的血浆蛋白标志物以高灵敏度和特异度开始受国内外学者关注。值得关注的是，MTB可导致血清TB相关蛋白水平变化。他们将利用血浆蛋白组织学技术鉴定并分析血清中与疾病相关特异蛋白质变化水平，为早期诊断提供可靠的理论依据。TB/HIV双重感染患者作为常见的结核特殊人群，免疫力极度低下，导致各项实验室检查结果阳性率低，故研究者开始应用血浆蛋白组织学技术探索血浆特异蛋白标志物。但目前国内外相关研究甚少，需进一步探索。TB/HIV患者血清蛋白组学研究结果初步显示，运用蛋白组织学技术鉴定、分析TB/HIV相关血清蛋白标志物。但是这些血浆蛋白标志物距离临床应用还需要很长一段时间，需要科学工作人员不断探索新型技术。