施肥对采煤塌陷复垦土壤理化性状和细菌群落结构影响的研究

丁嘉宁，梁利宝，冯鹏艳，许剑敏

（山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意义】山西省是全国重要的煤炭大省之一，同时也是采煤毁地的“重灾区”，全省因采煤造成的采空区面积近5000 km2，其中沉陷区面积约3000 km2，而且煤矿采空区仍以每年80 km2以上的速度扩大，大量耕地遭到严重破坏。主要因为塌陷区面积大，该区复垦对于提高土地资源利用率，促进农业发展有一定的帮助。但是复垦土壤是一种重构土壤，塌陷区的填土的来源主要是周边丘陵区黄土，土壤类型和质地与塌陷区相同，其土壤粒径大、养分低、生物活性差，加之在“混推”过程中大型机械设备对土壤的碾压，土壤生产力极其低下，因此，施肥成为加速复垦土壤熟化的一种可行性手段。

【研究进展】多数学者认为施肥可以改善土壤团聚体结构土壤质量和结构，提高土壤肥力养分和酶活性，增强土壤微生物活性。苏慧清等[1]研究发现有机肥处理显著增加了土壤中＞1mm 棕壤的团聚体量，无机肥处理显著提高了黏粉粒（＜0.053 mm 团聚体）的量，降低大团聚体（＞2 mm）与微团聚体（0.053～0.25 mm）量；Chaudhary 等[2]则认为无机肥的施加对土壤体积质量、土壤团聚性并不会产生负面影响。适当增加有机肥可以降低体积质量、增加大团聚体数量，改善土壤质量[3]。Bei 等[4]研究表明有机肥替代无机肥短期内显著提高土壤碱解氮、速效钾，也会显著增加全氮、有机质；但是，无机肥对全氮和有机质影响不明显。梁路等[5]研究得出黄土高原旱地麦田有机肥（30 t/hm2）配施无机氮（150kg/hm2）土壤有机质、养分和蔗糖酶、碱性磷酸酶和脲酶活性，要高于施氮量225、300 kg/hm2处理，这对实现我国2020年化肥用量零增长目标具有重要意义。大量研究结果表明不同施肥处理对细菌群落结构的影响也存在差异。Wang 等[6]研究表明有机肥处理的土壤细菌丰度明显高于无机肥处理，无机肥处理主要增加了拟杆菌门、酸杆菌门的丰度，有机肥则对大多数优势细菌都有促进作用。但Shi 等[7]研究发现无机磷的施入对于土壤细菌群落结构影响不显著。贾俊香等[8]研究表明施用生物炭明显提高了采煤塌陷复垦养分、酶活性，何冰等[9]研究表明单施有机肥可提高不同复垦年限土壤团聚体有机碳氮量及团聚体稳定性，复垦4、8a的土壤1～2 mm 团聚体比例最高，达到25%～31%。刘京等[10]研究施用有机肥降低了土壤＜0.01 mm 团聚体比例，增加了＞0.25 mm 团聚体比例。土壤团聚体的平均粒径团聚度越高，稳定性就越强，土壤肥力越高[11]。孟会生等[12]发现磷细菌肥提高了采煤塌陷区复垦土壤放线菌数量，且改变了放线菌群落结构组成。而关于不同施肥措施对采煤塌陷复垦土壤细菌群落结构变化的研究较少。

【切入点】综上所述，在不同环境条件下，施肥对不同类型土壤培肥效果存在差异，不同施肥方式对采煤塌陷复垦土壤的物理、化学以及对细菌群落结构影响如何，差异是否明显有待深入研究。【拟解决的关键问题】基于此，以晋东南地区采煤塌陷复垦2a土壤为对象，研究不同施肥处理对土壤理化性状以及细菌群落结构的影响并探讨其机理，旨在为加速复垦土壤熟化提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地点选在山西省晋城市北石店镇采煤塌陷复垦区，该地区属暖温带半温润大陆性季风气候，年平均气温5～10℃ ,年平均降水量550～650mm，无霜期150～170d。供试土壤基本理化性质见表1。

表1 供试土壤基本理化性质Table1 Basic physicochemical properties of tested soil

1.2 试验材料

供试玉米品种为泽玉41号，生育期为140 d 左右。供试化肥为尿素（N 46%）和过磷酸钙（P2O512%）、硫酸钾（K2O 43%）；供试有机肥使用腐熟鸡粪,有机质量为175.44g/kg，N 量为1.36%，P2O5量为0.95%，K2O 量为1.23%，含水率为30.6%，pH值为8.04。

1.3 试验设计

试验时间为2019年5—9月，共设置4个处理，分别是有机肥处理（M），无机肥处理（W），50%有机肥+50%无机肥处理（WM）和不施肥处理（CK），采用完全随机区组设计，每个小区面积20m2（4m×5m），每个处理重复3次。每个施肥处理施入等量的氮、磷、钾，N、P2O5、K2O 施入量分别为120、60 和98kg/hm2，单施有机肥处理养分不足，则用少量化肥补齐，对照不施肥。播种前所有肥料均一次性施入土壤，玉米在2019年5月2日播种，9月18日收获。玉米收获后采集0～20cm 土壤样品进行测定。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 土壤样品采集和前处理

土壤样品采集后取出石块、根系等杂物，过2mm筛后混合均匀，分成2 份，将其中1 份样品放置于无菌袋中-80℃保存用以土壤微生物DNA 提取；另1份样品则风干后，按照四分法，研磨、过筛，进行其他理化指标的测定。

1.4.2 土壤理化指标测定

土壤pH值采用酸度计测定（水土比5∶1）[13]；土壤体积质量采用环刀法测定[13]；土壤团聚体的测定采用干筛法[14]；土壤有机质采用油浴加热法测定[15]；土壤全氮采用开氏蒸氮法测定[15]；土壤碱解氮采用碱解扩散法测定[15]；土壤全磷采用钼锑抗比色法测定[15]；土壤速效磷采用0.5mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定[15]；土壤速效钾采用火焰燃烧法测定[15]；转化酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法[16]；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法[16]；脲酶采用靛酚蓝比色法[16]；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法[16]。

1.4.3 高通量测序方法

土壤细菌群落结构采用高通量测序（IlluminaMi seq PE300 测序平台）的方法测定。对16S rRNA 基因的V3-V4 高变区片段进行PCR 扩增，引物序列为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和8 06R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[17]。扩增条件为：95℃预变性3 min，接着进行29个循环，包括95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s；循环结束后72℃最终延伸10min，保持10℃直到停止。使用Trimmomatic 软件原始测序序列进行质控，使用FLASH 软件进行拼接；得到的序列用UPARSE 软件进行处理根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类，利用RDP classififier软件平台对OTU进行物种分类，从而获得每个OTU的分类学信息。

1.5 数据处理

利用Canoco5.0 软件对复垦土壤细菌与化学性质进行冗余分析（RDA），数据处理采用IBMSPSSSta tistics 21 进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤团聚体组成特征的影响

从表2可以看出，与CK相比，施肥对复垦土壤的体积质量影响不显著。与CK相比，M处理显著（p＜0.05）增加了＞2mm 大团聚体、1～2mm 较大团聚体比例，WM处理显著（p＜0.05）增加了1～2、0.25～1mm 较大团聚体比例，同时M、WM处理也都显著（p＜0.05）降低了0.053～0.25mm、＜0.053mm小团聚体比例，其中M、WM处理效果显著，W 处理的作用一般。对不同粒级的团聚体而言，无机肥表现出与有机肥较为相似的规律，但作用不如有机肥明显。

表2 不同施肥处理复垦土壤体积质量及团聚体组成Table2 Volume and mass of reclaimed soil and aggregate composition under different fertilization treatments

2.2 不同施肥处理对复垦土壤有机质和养分的影响

从表3看出，施肥后复垦土壤的pH值未发生显著变化。各施肥处理土壤有机质较 CK 提高了6.03%～12.02%，且M处理效果显著（p＜0.05）强于W 处理；各施肥处理土壤全氮、全磷量分别较CK 增加了8.33%～20%、13.63%～25%，碱解氮、速效磷、速效钾量则分别较 CK 增加了 11.96%～29.7%、7.03%～12.81%、6.66%～20.12%，施肥对土壤碱解氮效果最明显，速效钾次之，速效磷影响效果最小。对于全氮、全磷而言，M处理促进效果强于W 处理，对于速效养分而言，则正好相反。说明M处理的全氮、全磷较W 处理养分释放慢，因此前者的全氮、全磷量要高于后者，WM处理的作用基本是介于M、W 处理之间，但该处理与其余处理差异不显著。

表3 不同施肥处理复垦土壤有机质和养分Table3 Soil organic matter and nutrients were reclaimed by different fertilization treatments

2.3 不同施肥处理对复垦土壤酶活性的影响

从表4可以看出，不同施肥对复垦土壤酶活性均有不同程度的提高，过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶和转化 酶的较CK分别增加了1.14%～5.26%、3.17%～20.62%、9.57%～14.95%、2.34%～9.67%，说明施肥对土壤磷酸酶和脲酶活性效果最明显，过氧化氢酶、转化酶效果影响较为一般，其中M处理显著（p＜0.05）提高了磷酸酶、转化酶活性，W 处理显著（p＜0.05）提高了脲酶活性。

表4 不同施肥处理复垦土壤酶活性Table4 Enzyme activity of reclaimed soil under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理对复垦土壤细菌多样性的影响

从图1得出（图中横坐标为主要细菌群落的英文名称取前3个字母的缩写形式，Oth 代表其他细菌群落。），从门水平来看，不同处理复垦土壤主要细菌群落结构组成是相同的，按照丰度主要为：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）。变形菌门是土壤中丰度最高的优势菌，施肥后各处理的丰度增加了4.47%～18.34%，M、WM处理显著（p＜0.05）高于CK，M、W 处理土壤放线菌门丰度显著（p＜0.05）高于 CK，且显著（p＜0.05）降低了酸杆菌门（Acidobacteria）。M、WM处理显著（p＜0.05）降低了绿弯菌门的丰度。结果表明不同施肥处理中，M处理对复垦土壤细菌群落结构的影响最显著。

图1 不同施肥处理复垦土壤细菌门水平群落结构组成Fig.1 Community structure of bacteriophyta in reclaimed soil under different fertilization treatments

2.5 土壤养分与复垦土壤细菌多样性的相关性

不同施肥处理复垦土壤细菌群落多样性与土壤理化因子进行冗余排序分析（RDA）如图2所示。

图2 不同施肥处理下复垦土壤细菌群落与 土壤理化因子的冗余分析（RDA）Fig.2 Redundancy analysis of soil bacterial community and soil physical and chemical factors in reclaimed soil under different fertilization treatments（RDA）

RDA 图的第一排序轴和第二排序轴分别解释了57.98%和23.34%，累计解释量达81.32%，说明前2轴能较好地反映土壤细菌菌门丰度与土壤理化因子的关系。细菌门水平上，各处理在RDA 图上分布存在显著差异，CK 明显与其他处理分布位置不同，表明施肥后均会改变土壤细菌群落结构，M处理与CK的距离更大，说明M处理对土壤细菌群落结构影响更大。在8个土壤理化因子中，土壤体积质量（r=0.084）和pH值（r=0.268）与第一轴成正相关，有机质 （r=-0.788）与第一轴呈最大负相关，其次是速效磷（r=-0.767），全磷（r=-0.598），速效钾（r=-0.530），碱解氮（r=-0.498）和全氮（r=-0.489）。

全磷（F=4.7，p=0.002），有机质（F=5.3，p=0.004），碱解氮（F=5.8，p=0.004）和体积质量（F=4.1，p=0.008）是造成土壤细菌群落丰度差异的主要原因，土壤pH值的RDA 分析显示p=0.942＞0.05，对细菌群落结构没有显著影响。CK 在体积质量上的投影在正方向，而M处理和W 处理分布在体积质量的负方向，表明施用有机肥或者无机肥通过降低土壤体积质量与CK形成差异。CK 在有机质、速效磷、全磷、速效钾、碱解氮和全氮上的投影在负方向，施肥处理的投影分布在正方向，表明施肥提高了土壤理化因子从而与CK 产生差异。根据样本与理化因子垂直交点到箭头的距离可知体积质量对不同施肥处理土壤细菌群落丰度的影响大小排序：WM处理＞CK＞M处理＞W处理，而有机质、速效磷、全磷、速效钾、碱解氮和全氮对不同施肥处理土壤细菌群落丰度的影响大小排序为：M处理＞W 处理＞WM处理＞CK。

3 讨论

3.1 不同施肥处理对复垦土壤团聚体组成的影响

团聚体是土壤结构的基本单位,其粒级大小、含量直接反应土壤结构性的优劣，并成为土壤质量高低的主要指标。本研究发现（表2），1～2mm 团聚体是土壤的优势粒级，M、WM处理0.053～0.25mm、＜0.053mm的团聚体量较CK 显著降低，而1～2mm 团聚体增幅明显，可以推出施肥促进了二者间的转换，即小团聚体结合形成了大团聚体，但不能排除其他粒级的团聚体没有参与这样的转换。分析原因是有机质是土壤团聚体形成的主要胶结剂[18]，很大程度上影响了土壤中团聚体的数量以及稳定性。CK 由于土壤养分和有机质缺乏，微生物生长受到抑制，导致了团聚体稳定性下降，大团聚体量不断降低，小团聚体量增加。

3.2 不同施肥处理对复垦土壤养分和酶活性的影响

本试验发现，M处理的培肥作用较为明显，有机质、全氮、全磷量较CK 增幅分别为12.02%、17.55%、22.45%，达到差异显著水平，这与梁路等[5]的研究结论一致，一方面是因为有机肥带入土壤中一部分养分，另一方面是有机肥中含有的碳、氮的矿化速率远小于无机肥，因此有机肥的培肥效果要高于无机肥。W 处理的土壤有机质和全氮量较CK 增加不明显。

本试验中W 处理土壤脲酶活性增加最明显，原因是供试尿素为酰胺态氮素，它强烈激发了土壤中脲酶活性[19]，但是脲酶活性过高会加速尿素水解而导致氮损失。也有研究表明无机氮肥会降低脲酶的活性的报道[20]，这可能与土壤类型、施肥量等因素有关系。土壤磷酸酶是一类加速有机磷转化的水解酶，活性高低直接影响有机磷分解、转化，W 处理由于含有较多的无机磷酸盐，抑制了土壤中磷酸酶活性，有机肥中的有机磷直接激发了磷酸酶活性。于镇华等[21]研究得出无机肥抑制了过氧化氢酶活性，添加有机肥可以起到缓解作用。与CK相比，M处理增强了转化酶和磷酸酶的活性，因为有机质为酶提供合成底物[22]。有机肥本身C/N 超出了土壤微生物最佳范围，配施无机肥（尿素）后，降低了土壤C/N，微生物生命活动更加旺盛，从而释放更多的酶，因此WM处理土壤酶活性（脲酶除外）总体上略高于单施W 处理。

3.3 不同施肥处理对复垦土壤细菌群落组成的影响

细菌是土壤中数量最多（占总数70%～90%）、种类最丰富的微生物类群，几乎参与了土壤中所有的生物化学反应，对于维持土壤生态系统至关重要，其多样性可以指示土壤的生物活性。费裕翀等[23]研究发现有机肥无机肥配施处理中土壤变形菌门、放线菌门的丰度明显高于无机肥处理；聂三安等[24]研究得出有机无机配施放线菌的丰度显著高于无机肥处理，然而WM处理显著（p＜0.05）低于单施W 处理，根据刘平静等[25]研究表明70%N 有机+30%N 无机配施降低了放线菌门的丰度，这可能与配施比例和土壤类型有关。变形菌门是土壤中主要的异养型细菌，依靠外界提供有机碳源才能生存，酸杆菌门和绿弯菌门则主要是自养型微生物，本试验中M、WM处理较CK 显著（p＜0.05）提高了变形菌门丰度，同时降低了酸杆菌门和绿弯菌门的丰度，这与王齐齐等[26]的研究结论是一致的。细菌群落结构受到土壤类型和质地、pH值、施肥因素等多种因素的影响，pH值是主要影响因子[27]，本试验研究发现土壤pH值没有显著变化，与细菌群落丰度相关性均不显著，这可能与土壤类型、培肥时间、施肥量有关系。本试验得出体积质量是影响复垦土壤细菌群落结构显著因子之一，其对土壤的孔隙度及其大小分配有直接影响，改变土壤水、肥、气、热条件，因此也显著影响了土壤微生物活性和群落结构的变化[28]。土壤碱解氮、有机质、全磷也是影响供试土壤微生物群落结构的显著养分因子，C、N、P 是构成细胞结构基础物质，Coolon 等[29]研究表明氮素是影响土壤细菌群落结构最主要的因子。不论是有机氮肥还是无机氮肥，都可以直接抑制微生物的呼吸作用[30]，进而影响到微生物种群生长、繁殖。长期单施无机肥的土壤微生物碳源代谢模式较为单一，缺乏容易利用的碳源导致微生物利用碳源能力降低，微生物物种衰减。长期单独施用化肥导致某些土壤细菌种类富集或是某些种类的丧失[31]，配施有机肥则后改善了土壤微生物群落碳源代谢模式，提高了微生物群落碳源利用能力。

4 结论

1）M、WM处理均不同程度地降低了复垦土壤小团聚体比例，同时显著增加了较大团聚体比例，改善了复垦土壤团聚体结构。

2）M处理显著增加了复垦土壤有机质和全氮、全磷、速效钾和碱解氮量，且显著增加了磷酸酶和转化酶活性；W 处理则显著提升了土壤全磷量和脲酶活性；WM处理则明显增加了土壤全氮和速效养分。

3）土壤全磷、有机质、碱解氮和体积质量是造成土壤群落结构差异的主要因子。