ctDNA 在结直肠癌诊断中的应用进展

于恒响 周黎明

（1. 四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2. 四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041）

结直肠癌在世界范围内是最为常见的肿瘤之一，根据2018年全球癌症报告，结直肠癌新发病例占全部病例的6.1%，位居第四位[1]。在我国，报告显示2015年中国结直肠癌发病人数和死亡人数均位居第五位[2]。研究显示，结直肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的五年生存率分别为81.2%、71.7%、58.4%和14.4%[3]，然而由于发病隐匿，早期症状不明显，尽管早期结直肠癌患者拥有较高的五年存活率，但只有30%-40%患者在结直肠癌早期被确诊，60%-70%患者直到晚期时才能被确诊[4]。因此，结直肠癌的早期筛查及诊断具有重要意义。然而报道显示，在美国，2018年50岁至54岁人群筛查率仅为48%，55岁至64岁人群中的筛查率也只有68%[5]。目前，美国癌症协会（American Cancer Society，ACS）建议50岁以上人群定期进行结直肠癌筛查，包括：每年进行一次粪便免疫化学试验（Fecal immunochemical test，FIT），高灵敏度粪便隐血试验（High sensitivity guaiac fecal occult blood test，HSgFOBT）每年一次，多靶点粪便DNA检测（Multitarget stool DNA test，mtsDNA）每3年一次，结肠镜检查每10年一次，CT结肠造影（CT colonography，CTC）每5年一次，柔性乙状结肠镜检查（Flexible sigmoidoscopy，FS）每5年一次[6]。然而这些检查大多是侵入性的，具有有创性，无法进行长期检测，患者依从性不佳，且由于肿瘤的异质性，单一组织样本难以反映肿瘤的整体情况等缺点。除此之外，有研究表明与粪便标本相比78%患者更愿意提供血液样本[7]。因此，目前越来越多的研究投入到寻找基于血液样本的结直肠癌诊断方法，人们通常称之为液体活检（Liquid biopsy）。本文就ctDNA在结直肠癌诊断应用研究进展进行综述。

1 ctDNA的生物学特性

血液中含有许多有潜力用作生物标记物的物质，包括蛋白质、外泌体、核小体、循环癌细胞和循环肿瘤DNA等[8]。其中，循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）正逐渐受到人们关注。1948年，Mandel和Métais首次在人类血液中发现了非细胞游离核酸（Cell free DNA，cfDNA）[9]。cfDNA是在血液、粪便、尿液或唾液中均可发现的游离于细胞外的基因片段，它由核酸链组成，核酸链来源于多种细胞，包括但不限于肿瘤细胞。1989年，Stroun等通过比较DNA链的热力学稳定性，首次证实肿瘤患者外周血中的一部分cfDNA来源于肿瘤细胞，称之为ctDNA[10]。ctDNA是cfDNA中来源于肿瘤细胞的部分，由肿瘤凋亡、坏死，或循环肿瘤细胞裂解产生，但其具体机制尚不清楚[4]。Gasparello等用LoVo和LS174T两种细胞系进行了体内和体外实验，结果显示在体外LoVo细胞系比LS174T细胞更有效地释放ctDNA，而相反当这些肿瘤细胞作为异种移植物在小鼠体内生长时，LS174T 细胞系在血液中ctDNA含量更加丰富，且这种差别与“管家”因素无关，如细胞增殖，肿瘤异种移植物的生长，坏死或微血管密度。显示在细胞和全身两个方面存在有两种不同的途径影响ctDNA的释放[11]。

ctDNA长度在166 bp左右[12]，半衰期从15分钟到几个小时不等，通常被肾脏、肝脏和脾脏迅速清除。淋巴系统和血液的各种生理过滤（清除、降解等）也决定了血液循环中ctDNA的数量[13]。不同类型肿瘤ctDNA检出率不同，Bettegowda等报道结直肠癌、胃食管癌、胰腺癌和乳腺癌患者中ctDNA的检出率分别为73%、57%、48%和50%；不同分期患者ctDNA检出率也不同，有47%的Ⅰ期癌症患者可检出ctDNA，而 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌的ctDNA检出率分别为 55%、69% 和82%[14]。ctDNA的特征在于存在癌症相关的遗传和表观遗传突变，例如点突变，基因组序列重排，拷贝数变异（Copy number variations，CNV），微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI），杂合性缺失（Loss of heterozygosity，LOH）和DNA甲基化[15]。这些特征有助于将它们与剩余cfDNA片段区分开来，从而使ctDNA成为能够用于早期诊断与筛查，监测疾病状态、进展和复发的潜在生物标志物。

2 ctDNA在结直肠癌诊断应用

目前，已有多项研究阐释了ctDNA作为生物标记物用于结直肠癌诊断的价值。Yu等研究发现结直肠癌患者血液中ctDNA含量高于健康人，患者ctDNA样本与肿瘤组织样本的KRAS和BRAF基因突变一致性为92%[16]。Yang等研究发现结直肠癌患者血液ctDNA浓度随肿瘤大小增加而增加，I期与IV期患者之间ctDNA浓度具有显著差异。ctDNA 的检出率高于目前5种常用肿瘤生物标志物，包括癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）、糖类抗原19-9（Carbohy drate antigen 19-9，CA19-9）、癌抗原125（Cancer antigen125，CA125）、癌抗原72-4（Cancerantigen72-4，CA72-4）[17]。Hsu等检测了32例结直肠癌患者的ctDNA样本和肿瘤组织样本中的基因变异，发现他们之间的一致性很高（85%），且ctDNA水平的变化与肿瘤缩小显著相关；与ctDNA下降<80%的患者相比，治疗后ctDNA下降>80%的患者无进展生存期更长（HR，0.22）[18]。He等研究发现结直肠癌的分期、大小、浸润深度与检测灵敏度呈正相关，而不同部位的肿瘤间检测灵敏度无差异。浸润性结直肠癌比溃疡性和突出性结直肠癌表现出更高的敏感性，而不同组织学类型之间的敏感性没有差异。有远处转移的结直肠癌（M1）比无远处转移的结直肠癌有更高的敏感性，而有淋巴结转移的结直肠癌（N1和N2）与无淋巴结转移的结直肠癌相比无统计学意义[19]。可见，ctDNA检测相比其它常用肿瘤生物标志物具有优势，且能一定程度反应肿瘤负荷和肿瘤状态，在结直肠癌早期诊断应用前景广泛。

对ctDNA进行基因检测亦能用于结直肠癌早期诊断。Luo等对1493名结直肠癌高危人群进行的一项前瞻性队列研究，发现ctDNA甲基化标记cg10673833检测确定21例结直肠癌患者中的19例，8例原位结直肠癌患者中的7例，敏感性为89.7%（95%CI，0.727～0.978），特异性为86.8%（95%CI，0.849～0.884），AUC为0.90（95%CI，0.885～0.942）；对晚期癌前病变的敏感性为33.3%（95%CI，0.231～0.449），远高于无癌或晚期癌前病变的阳性率（12.1%；95%CI，0.101～0.139），有望成为一种有效的非侵入性的结直肠癌筛查工具[20]。Church等研究发现了ctDNA中 SEPT9基因甲基化检测敏感度为48.2%（95%CI 32.4%～63.6%）；结直肠癌Ⅰ～Ⅳ期分别为35.0%、63.0%、46.0%和77.4%；特异性91.5%（95%CI 89.7%～93.1%），显示其在结直肠癌筛查或诊断中的价值[21]。Cohen等人描述了一种多分析物试验（Cancer Seek），通过评估循环中蛋白和ctDNA突变水平，检测八种常见癌症，包括结直肠癌；使用对总共16种不同癌症基因中的多个突变的分析结合选定的蛋白质生物标志物，作者在43%的I期结直肠癌患者中检测到ctDNA，而在II-III期检测率为70%，特异性为99%[22]。Osumi等通过下一代测序（NGS）对血浆中结直肠癌常见的14种突变基因进行分析，发现血浆中突变基因频率与肿瘤转移（肝脏，淋巴结，转移器官数），肿瘤标志物（CEA，CA19-9，LDH）和肿瘤直径（最大值）显着相关[23]。Ou等利用集成化综合液滴数字检测（Integrated comprehensive droplet digital detection，IC3D）数字PCR系统提出了一种新的液体活检方法，该系统可大大提升ctDNA检测灵敏度，比现有的商业液体活检ddPCR和qPCR平台高50-1000倍。目前，该团队正在进行一项临床研究评估IC3D ctDNA检测对预测早期结直肠癌的微小残留病变和复发的预后的意义[24]。

ctDNA也可用于结直肠癌复发的监测，Scholer等对27名结直肠癌患者进行了纵向追踪，显示所有复发患者术后均检测到ctDNA（n=14），而非复发患者未检测到ctDNA。另外利用ctDNA检测复发，与CT相比，平均提前9.4个月[25]。Symonds等检测了144名患者的ctDNA BCAT1/IKZF1基因甲基化突变和CEA水平，显示甲基化ctDNA检测对复发的敏感性为66.0%（95%CI，57.1%-69.3%），显著高于CEA（31.9%；95%CI，22.8%-36.6%）；特异性无差异（ctDNA，97.9%；95%CI，93.2%-99.6%；CEA，96.4%；95%CI，91.4%-99.0%）[26]。Benesova等研究显示在22名复发患者中，22例ctDNA检测阳性（100%），而影像学检测到16例阳性（73%），肿瘤标志物升高15例（68%）[27]。Tie等检测了96例III期结肠癌患者的术后样本，发现20例中可检测到循环肿瘤DNA，并且与较低的无复发生存率相关（风险比，3.8；95%CI，2.4-21.0）[28]。Tarazona等同样报道了在接受辅助化疗的结直肠癌患者中，治疗后检测到ctDNA与复发相关（HR 10.02）[29]。

3 总结与展望

ctDNA检测具有非侵入、特异性高、敏感性高、以及能够全面反映肿瘤异质性等优点，在结直肠癌早期诊断中应用前景广泛。在预测化疗疗效和临床预后[30]，全面准确提供患者体内不同肿瘤的信息[31]，检测肿瘤耐药性[32]等方面亦具有使用价值。但ctDNA检测仍存在成本高、技术复杂、不同方法的结果尚无固定标准、可靠性与稳定性无法确定，且ctDNA产生机制尚不清楚等问题[33,34]。 因此2018年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美国病理学家学会（College of American Pathologists，CAP）的一篇联合评论认为没有临床实用性的证据表明ctDNA检测在早期癌症，治疗监测或残留疾病检测中的临床有效性。除临床试验之外，没有临床有效性或临床效用的证据表明ctDNA测定可用于癌症筛查[35]。ctDNA在结直肠癌诊断的应用仍需要进一步研究。