外泌体——卵巢癌诊断和治疗的新途径

张晶晶 李 蕾 彭 澎 沈铿

虽然卵巢癌的发生率居妇科恶性肿瘤第3位，但病死率却居首位。卵巢癌症状无特异性，CA125作为其肿瘤标志物仍不够理想，约70%患者发现时已为晚期。卵巢癌的标准治疗是手术及以铂类药物为基础的联合化疗，但这只能有效治疗部分早期患者，大多数晚期患者常在短暂的无病间期后面临疾病复发。外泌体基础研究的开展和深入揭开了其在卵巢癌发生、发展中的作用机制。近些年开展了将外泌体应用于卵巢癌诊断和治疗的探索，本文对此进行综述。

一、外泌体概述

细胞向外分泌的囊泡根据最大直径分为凋亡小体、微囊泡和外泌体，其中外泌体是最小的细胞外囊泡，直径30～100nm，密度1.13～1.19g/ml，透射电镜下呈杯状，低温电子显微镜下呈圆形[1]。

最初，外泌体发现于网织红细胞释放胶体金标记的转铁蛋白过程中。现已明确外泌体的形成过程分为如下几步：①细胞膜内陷形成含有膜表面蛋白及脂类的早期内涵体；②进入细胞内的早期内涵体再次向内凹陷包裹细胞质中漂浮的蛋白和RNAs，此时形成多囊泡体；③多囊泡体与细胞膜融合，以类似胞吐的形式将其中的小囊泡释放到细胞外基质中，至此外泌体形成[2]。众多细胞可分泌外泌体，如树突状细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、肥大细胞、神经元、血小板、肠上皮细胞等，因此，外泌体广泛存在于血浆、唾液、尿液、羊水、腹腔积液、乳汁等各种体液中[3]。

外泌体最重要的作用是参与细胞间通讯，其携带多种细胞表面分子，能同时与许多不同的细胞受体结合，还可通过直接融合以及细胞内吞将其携带的生物活性物质送入受体细胞内，如传递肿瘤细胞的致癌基因、传播病原体等；此外，外泌体还参与免疫应答、抗原递呈、细胞程序性死亡、血管生成、炎症、凝固等过程[4]。

外泌体通常携带了大量蛋白质、mRNA、microRNA、长链非编码RNA、脂类等，偶尔可见基因组DNA。截止2014年，据统计所有不同来源的外泌体包含4563种蛋白质，1639种mRNA和764种microRNA以及194种脂质，而这一数据还在增长[5]。由于外泌体起源于细胞膜，因此外泌体所有外泌体均携带参与膜转运和融合的蛋白质(GTP酶、膜联蛋白、脂阀结构蛋白)、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、热休克蛋白(Hsc70、Hsp90)、参与产生多囊泡体的蛋白(Alix、TSG101)、脂质相关蛋白和磷脂酶[6]。此外，外泌体还携带细胞特异性蛋白质，参与对应的生理病理过程，如对铂类耐药的卵巢癌细胞分泌的外泌体含有annexin A3，此蛋白质参与卵巢癌细胞的铂流出过程[7]。

目前，对外泌体RNAs的研究主要集中在mRNA和microRNA。2007年的一项研究首次揭示外泌体中含有mRNA和microRNA，并发现通过外泌体转移的mRNA可以在受体细胞内发挥作用[8]。外泌体携带的microRNA也具有特异性，如通常在恶性肿瘤中升高的miR-21，在卵巢癌源性外泌体中的含量较其他卵巢良性疾病来源的外泌体中的含量要明显升高[9]。外泌体携带的脂类也与其最主要的细胞间通讯功能相符。外泌体富含的脂质为一些筏相关脂质，如神经酰胺、鞘磷脂、磷酸甘油酯、胆固醇等，其中胆固醇主要存在于B淋巴细胞来源的外泌体，这提示不同细胞来源的外泌体所富含的脂质成分也是有差别的[6]。

二、提取外泌体的技术难点

提取高纯度外泌体的难点在于：①微囊泡的直径为100～1000nm，容易与外泌体混淆；②不同细胞来源的细胞外囊泡混合于细胞外间隙；③单细胞可以分泌不同细胞内来源的外泌体。提取高纯度外泌体的最佳方法还在探索中。差异超速离心法是最早使用的方法，也是目前最广泛使用的方法，通常与蔗糖垫或蔗糖密度梯度离心法联合使用。但该方法缺点颇多，包括步骤繁琐、耗时耗力、处理样本量小、外泌体产量少、实验耗材多等，难以在临床大规模推广使用[6]。很多人尝试使用其他方法包括超滤联合排阻色谱法、声纳滤技术等以提取高纯度外泌体，但技术尚不纯熟[10,11]。目前，也有提取外泌体的商品化试剂盒，采用亲和性膜离心柱纯化外泌体，在此基础上利用QIAzol细胞溶解试剂裂解外泌体获得其内RNA[12]。虽然，商品化试剂盒能够快速、便利地获得结果，但价格昂贵。

三、外泌体在卵巢癌发生、发展中的作用

恶性肿瘤由肿瘤细胞及肿瘤基质组成，肿瘤基质由基质细胞、细胞外基质以及细胞外囊泡形成复杂肿瘤微环境。肿瘤细胞释放外泌体是向肿瘤微环境传递信号的一种方式。肿瘤细胞所释放的外泌体的数量以及外泌体携带的蛋白质和microRNA的量较正常细胞均更多[13]。外泌体作用于在肿瘤发生、发展的多个阶段，包括诱导非肿瘤细胞向肿瘤细胞转化、肿瘤细胞的免疫调节、侵袭和转移、耐药、肿瘤血管生成等。

有研究发现卵巢浆液性癌外泌体中的miR-21通过下调抑癌基因——细胞程序性死亡基因-4的表达以促进靶细胞发生致癌性转化[14]。卵巢癌外泌体或直接或间接地参与免疫调节过程。卵巢癌患者腹腔积液中的外泌体在树突状细胞存在时，可损伤外周血单核细胞的细胞毒活性[3]。卵巢乳头状浆液腺癌来源外泌体内含FasL，可直接诱导T细胞凋亡[15]。

不同病理类型卵巢癌细胞甚至同一病理类型不同个体的卵巢癌细胞侵袭能力不同，体现在外泌体所携带的与侵袭能力相关的生物活性物质上。卵巢癌细胞的向外迁移，最先通过腹腔积液循环播散至腹腔，卵巢癌细胞能够通过外泌体向腹膜间皮细胞传递CD44，继而促使腹膜间皮细胞通过分泌MMP9和清除间皮障碍来提高细胞的侵袭性[16]。LIN28是一种RNA结合蛋白，调节mRNA和microRNA，与人类晚期恶性肿瘤相关，且常表达于卵巢肿瘤中。体外实验发现含大量LIN28的人类卵巢癌细胞分泌的外泌体能增加HEK293细胞的上皮间质细胞转型相关基因表达，诱导其侵袭和迁移[17]。外泌体对肿瘤细胞迁移能力的影响并非单向，有实验揭示上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)对肿瘤细胞迁移起到促进还是抑制作用取决于肿瘤类型，在人类上皮性卵巢癌中为抑制细胞迁移作用[18]。

外泌体还多方参与卵巢癌耐药形成。溶酶体作为细胞内运输金属的集装箱，起到接收、储存、分配金属的作用。在铂类耐药的卵巢癌细胞中，其溶酶体体积较铂类敏感的卵巢癌细胞明显缩小，是因为溶酶体内的溶酶体相关蛋白1(lysosome-associated proteins-1，LAMP1)减少，但细胞释放的外泌体中LAMP1、铂类及其转运蛋白MRP2、ATP7A和ATP7B含量增多[19]。还有研究发现膜联蛋白A3与外泌体数量有关，铂类耐药的卵巢癌细胞膜联蛋白 A3表达增多，促进细胞内多囊泡体形成，继而促进外泌体形成，将铂类药物转出细胞[7]。外泌体不仅参与卵巢癌细胞对铂类耐药，也参与对紫杉醇耐药。肿瘤微环境中的肿瘤相关脂肪细胞和成纤维细胞通过外泌体将miR-21转移肿瘤细胞并直接结合凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor-1，APAF1)，由于APAF1赋予卵巢癌细胞对紫杉醇敏感，因此APAF1失活导致卵巢癌细胞对紫杉醇耐药[20]。

卵巢癌外泌体在促进肿瘤血管生成方面的研究不多。有蛋白质组学揭示了一些潜在涉及卵巢浆液性癌血管生成的外泌体蛋白质ATF2、MTA1、ROCK1/2[21]。

四、外泌体作为卵巢癌潜在的新肿瘤标志物

目前卵巢癌的诊断仍然依靠腹痛、腹腔积液、腹胀等症状，联合血清CA125及影像学检查。CA125对于卵巢癌来说特异性和敏感度均欠佳，仅50%的FIGO分期Ⅰ期的卵巢癌患者出现CA125升高。因此更特异和敏感的卵巢癌肿瘤标志物亟待被发掘。

外泌体microRNA作为卵巢癌肿瘤标志物有其独特的优势：①外泌体microRNA较CA125特异性强；②肿瘤细胞分泌外泌体量大，外泌体携带microRNA量大；③外泌体存在于各种体液中，获得检测样本容易；④外泌体microRNA稳定性好，因有囊泡包裹可有效预防其被降解；⑤可用于卵巢癌的分期、诊断，提示卵巢癌的转移、耐药及评估预后，用途多样。自2008年Taylor等[9]首次提出通过检测血浆中外泌体microRNA来诊断卵巢癌，越来越多的外泌体microRNA作为卵巢癌潜在的新肿瘤标志物不断被发现(表1)。

表1 外泌体microRNA作为卵巢癌肿瘤标志物

卵巢癌外泌体内存在一些特异性蛋白质，并在卵巢癌早期、晚期及化疗前后含量发生变化，因此这些特异性蛋白质也可能成为潜在的卵巢癌肿瘤标志物。已报道可诊断和(或)提示预后的外泌体蛋白质为EpCAM、CD24以及CD24联合EpCAM、活化白细胞黏附分子、核仁磷酸蛋白、组织蛋白酶D、p53、SSX共同抗原、紧密连接蛋白claudin-4等[18, 27～30]。可提示卵巢癌期别早晚的外泌体蛋白质有胎盘碱性磷酸酶、TAG 72、存活蛋白、NY-ESO-1、GRP78和Muc16[29]。反映化疗效果者为膜联蛋白A3、EpCAM联合CD24[7,31]。

外泌体作为卵巢癌细胞持续释放的信号，很可能较异常升高的血清CA125异常更早被检测到。卵巢癌患者如能早期诊断并规范治疗，预后将会明显改善。哪种外泌体miRNA和(或)蛋白质是卵巢癌的最佳肿瘤标志物尚待筛选比较，且目前研究多针对上皮性卵巢癌，外泌体作为其他病理类型卵巢癌的肿瘤标志物在未来的研究中也应考虑。

五、外泌体在卵巢癌治疗中的应用

鉴于外泌体广泛参与卵巢癌的发生、发展，因此，也可多途径应用于卵巢癌治疗。目前已经证实有效的途径为减少外泌体数量、外泌体介导免疫治疗、外泌体作为药物载体。

Marleau等[32]提出一种可以嵌合到血液透析机的亲和平台装置，可通过该装置过滤和清除外泌体作为癌症治疗的辅助方法。也有研究提出可使用阿米洛利以减少外泌体形成[33]。

多项Ⅰ/Ⅱ期临床试验证实外泌体在恶性黑色素瘤、晚期非小细胞肺癌、结直肠癌免疫治疗中的安全性和有效性[34]。众多研究正在逐步揭卵巢癌外泌体参与的免疫调节机制，对其全面、透彻的认识有助于阻止卵巢癌细胞免疫逃逸和增强卵巢癌患者抗肿瘤免疫反应。外泌体在卵巢癌免疫治疗方面的临床试验尚为空白，但外泌体在其他恶性肿瘤免疫治疗的成功经验可以借鉴。

有研究者比喻外泌体为“公交车”，恰好可以利用外泌体的载体角色携带药物以治疗疾病，其优势在于无细胞毒性、低免疫原性、能穿越生物屏障、保持药物生物活性状态、靶向作用于器官/细胞。以外泌体作为阿霉素或紫杉醇载体的动物实验研究结果显示，外泌体能够将化疗药物运送至肿瘤并抑制肿瘤生长且未观察到不良反应[35,36]。此外，还有实验向外泌体导入外源性小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)作为其负载药物以治疗肿瘤，这在宫颈癌治疗中显示是有效的。有研究者将靶向沉默RAD51的外源性siRNA导入宫颈癌HeLa细胞来源的外泌体，发现它能够有效抑制受体肿瘤细胞RAD51的基因表达，并引起肿瘤细胞大量死亡。

六、展 望

外泌体携带其来源细胞大量的生物学信息、广泛参与各种生理病理过程，现已探知的或是冰山一角，更深度的蛋白质、RNA测序还需继续，其与肿瘤微环境的相互作用机制也需进一步明确。便捷高效且经济的提取高纯度外泌体的技术方法仍待发现，这限制了其应用于临床中。现已筛选出一些外泌体所携带的生物活性物质作为卵巢癌潜在肿瘤标志物，但还有大量工作需要完善，一方面需要确定这些生物活性物质中哪种为最佳选项，另一方面还需要与传统的卵巢癌肿瘤标志物CA125进行对比，这不妨碍外泌体成为极具前景的卵巢癌新型肿瘤标志物，以期早期诊断卵巢癌。鉴于外泌体在其他肿瘤治疗的成功经验，将外泌体应用于卵巢癌的治疗是可行的，但需基于前述问题的解决，或能带来较目前已有药物更好的治疗效果。