核苷酸酶CD73在恶性肿瘤中作用和调控机制的研究进展

戚玉竹，刘 静，张国君

(汕头大学医学院长江学者实验室，广东省乳腺癌诊治研究重点实验室，广东 汕头 515041)

研究表明，核苷酸酶CD73 在多种人类肿瘤中呈高表达状态，与多种肿瘤的发生发展、转移和不良预后密切相关[1]。但在不同肿瘤中，CD73 的作用方式和具体分子机制各有差异，因此，本文将围绕CD73 在肿瘤生长、转移过程中的作用及分子机制展开论述，旨在为恶性肿瘤患者的个体化治疗提供新的潜在治疗方案。

1 核苷酸酶CD73

人CD73是由NT5E基因(位于6q14-21)编码的523个氨基酸组成的多功能跨膜糖蛋白，相对分子质量为70 000，其通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)锚定在细胞膜上[2]。研究发现，CD73广泛表达于人体多种组织细胞表面，包括淋巴细胞、内皮细胞和上皮细胞，控制多种生理作用，如上皮离子交换、液体转运、血小板功能、组织乏氧以及血管渗漏等[3]。

CD73蛋白由3个结构域组成，N端结构域(27-317AA)包含2 个锌离子结合位点和至少1 个位于311 位天冬氨酸的N-糖基化位点；C 端结构域(337-549AA)含有底物结合位点，并通过GPI 锚定器非共价结合到质膜上；N 端和C 端结构域通过一个短螺旋(318-336AA)连接，其可控制酶的运动。因此，CD73存在“开放”和“封闭”两个构象，而催化反应需要CD73 从开放构象转换为封闭构象，后者可暴露活性结合位点，允许底物结合[4]。

2 CD73在肿瘤发生发展中作用的分子机制

2.1 CD73水解酶功能在肿瘤发生发展中的作用

CD73 是核苷酸酶，可水解细胞外5′-单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，使其去磷酸化生成腺苷，并通过腺苷能信号通路起作用，而5′-AMP 的离解常数和抑制常数通常在低浓度范围内(约50 μmol/L)[5]。在细胞中，CD39 和CD73 协同作用产生细胞外腺苷，即CD39 催化ATP 降解为AMP，CD73 进而水解AMP 为腺苷。前一过程可在膜结合再生酶的作用下逆转，而CD73水解AMP生成腺苷是不可逆的过程。

除AMP 外，CD73 还可催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和烟酰胺单核苷酸，并降解为腺苷和烟酰胺核糖体，虽然该催化程度低于对AMP 的作用，但该发现提示了CD73 在NADH 代谢中的潜在新作用[6]。

CD73 的水解酶功能可影响肿瘤细胞的能量供给，对肿瘤发生发展的影响是多方面的。

2.1.1 促进细胞增殖Zhi 等[7]发现CD73 在乳腺癌组织中表达较高，且与恶性程度正相关。在乳腺癌细胞MDA-MB-231 中过 表 达 CD73 后 ，CD73 可 通 过 激 活 Akt/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1信号通路促进乳腺癌细胞的增殖活性。反之，当利用干扰技术在MB-MDA-231细胞中敲减CD73的表达后，肿瘤细胞在异种移植瘤实验中生长速度均明显降低，且晚期凋亡细胞比例显著增加。

此外，在乳腺癌细胞中过表达CD73，其酶活性可促使细胞进入S 期，G0/G1 期细胞比例减少，显著增加细胞生存能力，促进细胞周期进展。相反，抑制CD73 促进细胞更多进入G0/G1 期，S 期细胞比例减少。使用CD73 抑制剂α，βmethylene ADP(APCP)也有相似的周期抑制作用[7]。

2.1.2 介导免疫逃逸免疫逃逸也是恶性肿瘤在体内迅速增殖的机制之一，为肿瘤的免疫治疗提供了新的理论基础。研究发现，CD73 可介导细胞毒性T 淋巴细胞逃避。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)依赖的转录机制可促进CD73+细胞在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的积聚；反之，抑制HIF 活性可阻断化疗诱导的CD73+细胞的富集，导致T细胞功能衰竭或死亡[8]。

此外，由于CD73 产生的游离腺苷可抑制细胞免疫反应，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸，提示CD73 可作为抑制性免疫检查标记物[9]。

2.1.3 参与肿瘤血管生成 血管生成对恶性肿瘤的生长、转移和预后有重要的影响，是重要的独立预后标志。当肿瘤细胞中CD73 的活性受到抑制时，肿瘤异种移植物的血管生成减少，提示该酶参与了肿瘤血管生成。CD73+/+肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMECs)较 CD73-/-的PMECs更容易形成毛细血管样结构，且在肿瘤条件性培养基中培养时表现得更为明显。同时，CD73 可降低内皮细胞对IV 型胶原的黏附，促进肿瘤细胞的迁移。此外，裸鼠实验也证实，CD73+/+肿瘤大小和血管生成程度均高于CD73-/-小鼠，提示腺苷可以刺激血管生成[10]。

2.1.4 肿瘤组织屏障功能 许多研究表明，CD73 可参与肿瘤组织屏障功能的控制。白细胞，特别是多形核白细胞(中性粒细胞)在血管内皮细胞中的成功转移是通过局部连接间隙的扩大和暂时的自变形来完成的[11]。研究发现，无论是使用APCP 还是抗CD73单克隆抗体1E9均可通过抑制CD73活性，进而抑制其酶解产生腺苷及细胞外核苷酸代谢通路，可抑制高达85%的内皮和上皮屏障的再密封功能。而中性粒细胞来源的AMP产生的腺苷通过激活腺苷A2B受体偶联到细胞骨架的连接来增强屏障功能[12]。

2.1.5 产生耐药性 Samanta 等[8]在研究中还发现，在TNBC 中化疗药物(卡铂、阿霉素、吉西他滨或紫杉醇等)可通过调控HIF的活性，进而转录上调CD47、CD73 和PDL1 的表达，导致CD47+/CD73+/PDL1+乳腺癌细胞比例显著升高，产生的腺苷使T细胞功能受损，抗肿瘤免疫功能下降。而Turcotte 等[13]。在FinHER 临床试验中证实HER2基因扩增的202例患者的基因表达谱，发现低CD73水平(中位数以下)的乳腺癌患者曲妥珠单抗治疗明显获益，而CD73水平高(中位数以上)的乳腺癌患者无显著获益。在乳腺癌细胞H2N100皮下移植瘤小鼠模型中，CD73过表达可明显抑制抗erbb2 mAb 的活性。由此证明CD73 与HER2/ErbB2抗体治疗耐药有关

CD73 可通过直接的、细胞自主的代谢改变，介导肿瘤对铂类化疗的敏感性。Peng 等[14]研究发现，CD73 可通过介导AKT/GSK-3β信号通路的活性促进肾癌细胞对舒马替尼耐药的发生。CD73在乳腺癌细胞BT-549和MDA-MB-231中表达相对较高，而沉默CD73 可逆转其对顺铂的敏感性。临床样本的研究中也发现，CD73 在获得铂类抗性的细胞系中的表达高于敏感细胞系[15]。

2.2 CD73非水解酶功能在肿瘤发生发展中的作用

研究发现，CD73 除了其酶解AMP 参与腺苷通路发挥的作用外，还可作为调节细胞和细胞外基质成分相互作用的信号和黏附分子，调控肿瘤的侵袭和转移能力，具有重要的非水解酶

Airas等[16]利用单克隆抗体4G4识别功能，证实淋巴细胞血管黏附蛋白2(lymphocyte-vascular adhesion protein 2，L-VAP-2)和CD73是相同的糖蛋白，因此CD73作为黏附分子调节淋巴细胞对内皮细胞的黏附作用。CD73 还可以下调血管内皮细胞黏附分子在血管内皮细胞的表达，调节血管的通透性[6]。在黑色素瘤中，CD73可与Concanavalin a 相互作用导致脂质筏与细胞骨架复合物的联系增加。CD73 表达减少后，对Tenascin C层的黏附明显减弱。提示CD73 除了酶解产生腺苷外，还可能在与细胞外基质成分的黏附和相互作用中发挥独立作用[17]。

另有研究显示，肿瘤细胞中CD73 和表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)表达呈正相关关系，CD73 可调节人乳腺癌细胞的EGFR 表达及其磷酸化，提示CD73可通过调控EGFR的表达来促进肿瘤细胞增殖[18]。

3 恶性肿瘤中CD73表达调控机制

CD73的表达受多种因素调控，与HIF、IFN-α等因子密切相关。雌激素受体(estrogen receptor，ER)、Wnt/β-catenin 和SMAD 信号通路以及microRNA 可以直接参与转录调控CD73 的表达，且CD73 的酶解产物腺苷可通过反馈调节影响其表达。此外，化学物质也可影响CD73的表达水平。

众所周知，肿瘤组织内普遍缺氧，而缺氧条件可诱导肿瘤细胞内产生HIF 二聚体，后者可与CD73基因启动子中乏氧反应元件(hypoxia-responsive elements，HRE)直接结合，从而促进CD73的转录[19]。

而干扰素IFN-α则可通过诱导其他调控介质间接促进CD73基因转录。在膀胱癌模型中，IFN-α膀胱灌注后，可促进内皮细胞产生CD73，且呈时间和剂量依赖性，在体内血管系统中CD73的上调显著增加CD73介导的腺苷的产生，导致内皮细胞通透性降低，提示IFN-α是CD73 的体内调节因子，可通过CD73依赖性的腺苷产生，进而控制其诱导炎症的程度[20]。

通过对体内信号通路的机制研究发现，在乳腺癌中发现ER 负调控CD73 的表达，ER 的缺失可显著增强了CD73 的表达。雌二醇与ER 结合后，ER 入核与CD73基因启动子Sp-1和Ap-2 结合位点，下调CD73基因的表达[21]。染色质免疫共沉淀检测显示转录因子SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5 和SP1可与CD73启动子结合，提示人类CD73的表达可能受到SMAD转录因子的调控[22]。

值 得 注 意 的 是 ， CD73 的 3′非 翻 译 区 (3′-untranslated region，3′-UTR)包含1 774个核苷酸，超过了人类3′-UTR平均长度约3 倍[23]，因此，microRNA 对CD73 表达的转录后调控尤为重要，现已报道miR-30s、miR-187、miR-193b、miR-340及miR-422a等可直接靶向CD73 mRNA并抑制其表达[24-25]。

有趣的是，CD73 的产物腺苷可通过激活瘤细胞表面腺苷受体，增加细胞内cAMP水平，而cAMP与CD73基因启动子中的cAMP应答元件(cAMP response element，CRE)直接结合，进而正反馈性上调CD73基因的转录[26]。此外，Yang等[27]通过高效液相色谱法测定，发现化学物质硫木林富马酸氢(tiamulin，THF)通过降低CD73 的活性，而非CD73 的表达来抑制其作用，显著抑制乳腺癌的生长和转移。

4 以CD73为靶点的抗肿瘤治疗潜能

Zhi 等[7]利用siRNA 干扰技术使CD73 功能缺失，发现细胞与基质的黏附能力、生长和侵袭能力显著降低。目前研究提示单抗和化学药物等靶向CD73 的多种应用在肿瘤干预中发挥重要作用。

免疫疗法是一种新兴的干预手段，通过直接刺激排斥类型的过程或阻断抑制途径，改变患者的免疫系统以对抗癌症。在人类免疫系统中，CD73广泛表达于T细胞和B细胞亚群、生发中心滤泡树突状细胞、胸腺髓质网状成纤维细胞和上皮细胞。研究表明，抗CD73单克隆抗体导致CD73细胞表面聚集，继而发生内化，从而抑制循环肿瘤细胞的外渗和定殖能力，进而抑制肿瘤转移[28]。因此由核苷酸酶CD73产生的细胞外腺苷可作为一个新发现的干扰抗肿瘤免疫反应的“免疫检查点”。Stagg等[29]在免疫健全的小鼠模型中，用抗CD73单抗成功阻断了乳腺癌细胞CD73 的功能，显著降低肿瘤生长速度和自发肺转移的能力，但在免疫缺陷的小鼠模型中，单抗治疗对肿瘤生长速度无影响，提示抗CD73 单抗的抗肿瘤作用需要机体适当的免疫力为基础，而抗CD73的单克隆抗体还可以增强多克隆NK细胞对人卵巢癌细胞的溶解活性。

CD73 的抑制剂APCP 可选择性抑制CD73 的生物活性，控制胞外腺苷的浓度以及调节其受体的活性，调节腺苷的生物信号转导。Antonioli等[30]在小鼠黑色素瘤模型中，研究APCP联合抗细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4)的单克隆抗体的联合作用，结果发现，APCP可增强抗CTLA-4单抗的活性，阻断调节T细胞发挥功能中其关键作用的腺苷A2A受体，显著抑制黑色素瘤的生长、增强抗肿瘤免疫反应，效果明显优于两者的单独治疗效果。另外，CD73 可促进体内有B16F10 黑色素瘤细胞的C57BL/6小鼠的新生血管形成，而抑制CD73可降低新生血管的数量并阻碍新生血管的成熟，从而减弱黑色素瘤的血管生成。

综上所述，利用CD73 单克隆抗体、小干扰RNA 技术、CD73 抑制剂，均可显著抑制肿瘤细胞生长和转移，为抗肿瘤治疗提供了新途径。

5 展 望

研究表明，CD73 在恶性肿瘤发生发展过程有着重要作用，且CD73 的过表达与不同类型肿瘤患者的治疗疗效差和不良生存预后密切相关，提示CD73 有可能成为预测恶性肿瘤患者预后的生物标志物。通过单抗及化学方法抑制CD73 后，小鼠异体移植模型中肿瘤的生长及转移得到抑制，抗CD73 治疗与抗其他靶点单抗的联合抗肿瘤效果更加明显。目前，抗CD73 治疗在小鼠模型的研究中并未出现严重的不良反应。由于CD73在生物体内的功能极其复杂，靶向CD73的新型治疗模式必须对其可能会出现的不良反应进行严格论证才能应用于临床。未来，更多的研究将致力于完整深入地阐述调控CD73 的酶活性及其参与的腺苷通路的理论，和进一步发掘CD73基因表达调控的机制。由此可以设计针对性的干预对策，从信号转导通路和酶活性调节来抑制CD73 的功能，使之成为多种恶性肿瘤药物治疗的重要靶点。