核酸适体在癌症诊疗中的研究进展

董 倩，李兆倩，彭天欢，陈 卓，谭蔚泓，3，4

（1.湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,2.分子科学与生物医学湖南省重点实验室,长沙410082；3.上海交通大学医学院分子医学研究院,附属仁济医院,上海200240；4.中国科学院肿瘤与基础医学研究所,中国科学院大学附属肿瘤医院,杭州310022）

人口老龄化加剧、恶化的环境和不良的生活习惯等导致癌症在全球处于持续高发状态，成为危害人类健康的主要疾病之一［1］.提高癌症患者生存率和生活质量是癌症诊疗领域的主要目标［2］.为实现这一目标通常采用2种关键策略：（1）早期筛查/诊断，在癌症发展初期实现有效诊断可提高治疗效果及治愈概率［3～8］；（2）靶向治疗，实现药物的肿瘤特异性递送与富集可有效提高治疗效果，降低药物导致的系统性毒副作用，改善癌症患者的生存质量［9～16］.实现以上2种策略的关键在于发展肿瘤细胞特异性分子工具［17～21］，实现肿瘤细胞的高效、特异性分子识别.

核酸适体也被称为“化学家的抗体”，一般是指分子大小介于25～60个核苷酸的单链寡核苷酸序列［22］.它通过折叠成稳定的三维结构与靶标分子产生特异性分子间相互作用.核酸适体具有与抗体相当或更优异的特异性和亲和力，且兼具靶标范围广、生产成本低、易规模化制备、可实现精准化学合成和修饰以及免疫原性低等优势［23］.近年来，随着核酸适体开发技术的不断发展，基于核酸适体的肿瘤学研究取得了突破性进展，为癌症早期筛查、诊断及靶向治疗分子探针的开发提供了全新的策略.

核酸适体可通过多种作用机制应用于癌症的诊断及治疗：（1）分子影像探针的构建，通过对核酸适体进一步功能化修饰，利用成像分析手段评估相应生物标志物水平的变化，对肿瘤进行分子水平精准分型，为癌症的精准诊断和治疗提供可靠保障［24～29］；（2）核酸适体作为捕获探针，可实现外周血中肿瘤标志物及循环肿瘤细胞的高效捕获，用于癌症的诊断分型，为治疗提供可靠的用药指导及预后评估［30～33］；（3）直接作为治疗药物，通过与靶标蛋白的有效结合，影响相应受体的生物活性，从而实现抑制肿瘤生长［34～38］；（4）将核酸适体作为靶向分子，通过构建核酸适体-药物偶合物、复合纳米探针等，实现药物的精准投递，降低系统性毒副作用，提高综合治疗效果［30～33，39～49］.

本文综述了近年来核酸适体筛选技术的发展、肿瘤检测探针的开发及其在癌症早期诊断、分型、靶向治疗等方面的应用；探讨了核酸适体临床应用所面临的一些挑战和未来的发展方向.

1 核酸适体分子探针的筛选与构建

1990年，Ellington和Gold等［50，51］首次利用指数富集配体系统进化技术（SELEX）分别筛选得到了有机染料分子和蛋白酶分子特异性核酸适体，随后特异性结合不同靶标（金属离子、小分子、生物大分子和细胞等）的核酸适体被相继开发.其中，Tan等［52，53］开发的活细胞核酸适体筛选技术是核酸适体筛选领域取得的代表性技术成果，在分子靶标未知的前提下，直接以目标细胞作为筛选靶标得到活细胞特异性核酸适体分子探针，为肿瘤细胞特异性分子探针的开发提供了强有力工具［24～28，53～57］.核酸适体作为一类重要的功能核酸，对特定靶标分子的高特异性和高亲和力使其可以在分子水平区分肿瘤细胞分子靶标的表达差异，实现对肿瘤细胞/组织的高效精准识别［52］；也可通过与特异性受体结合，特异性影响肿瘤细胞表面异常受体的活性，从而抑制肿瘤生长［53］.

活细胞核酸适体筛选（Cell SELEX）技术［49］操作流程如图1所示.第一步，将目标细胞与文库序列混合孵育，通过离心去除未结合序列后回收与目标细胞结合的序列；第二步，将回收的序列与对照细胞混合孵育，通过离心去除非特异性结合序列后回收游离的序列，形成缩小的文库；第三步，通过PCR扩增技术对缩小的文库扩增后进入下一轮筛选.经过多轮的筛选、测序及序列优化，即可得到与目标细胞特异性高亲和力结合的核酸适体分子探针.活细胞筛选技术的优势在于细胞表面蛋白分子的构象可以得到很好的保护，能更好地反映其在肿瘤组织中的原始状态.目前，利用活细胞核酸适体筛选技术，已开发出可特异性靶向白血病、胰腺导管癌、结肠癌、非小细胞肺癌及乳腺癌等多种癌症细胞的核酸适体分子探针［58～62］，有效解决了肿瘤特异性分子探针匮乏的现状.

Fig.1 Schematic of the cell-based aptamer selection[49]

核酸化学的快速发展为核酸适体的性能改进及功能化修饰提供了有力保障.现有的核酸适体修饰方法可实现核酸序列不同位点的定点修饰，包括末端修饰、中间修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰及五碳糖修饰等［63，64］（图2）.通过以上修饰方法可实现核酸适体的荧光标记、放射性同位素标记及药物负载等多重功能修饰，同时可有效改善核酸适体在活体内的稳定性、代谢动力学等重要参数［65，66］.其中，在寡聚核苷酸的3′-或5′-端修饰聚乙二醇（PEG）是重要的策略.PEG缀合后，可避免核酸适体与血清中成分的相互作用，降低免疫原性，延长核酸适体的循环时间［67］；而将核酸上的2′-OH转变为2′-NH2，2′-OMe或2′-F则可有效提高RNA适体的抵抗核酸酶降解能力［68］.

Fig.2 Common strategies in the chemical modifications of nucleic acid aptamers and their purposes[64]

2 核酸适体用于癌症诊断及早期筛查

通过在核酸适体上进行影像分子（放射性同位素分子、荧光分子和拉曼报告分子等）修饰，可实现癌症诊断分子探针的构建，并高效地区分正常组织与肿瘤组织［69］.如Ng等［70］利用64Cu标记特异性靶向核仁蛋白的核酸适体AS1411，在体内和体外实现了对肺癌细胞的有效成像.Zhang等［71］利用多种核酸适体分别结合不同的荧光团实现了细胞膜表面不同受体的区分，继而区分不同种类细胞.Tan等［72］设计了一种新型的环状二价核酸适体，提高了其在生物体内应用时的热稳定性、抗酶切能力和亲和力，在活体实验中实现了有效成像（图3）.Liu等［73］利用组织筛选技术获得了特异性靶向甲状腺乳头状细胞的核酸适体TC-6，利用FITC荧光分子标记后，可以直观反映出正常组织与肿瘤组织的差别.Chen等［74］通过化学气相沉积法制备了同位素掺杂石墨烯纳米囊包裹金纳米晶材料，并利用其2D峰作为稳定的多色拉曼输出信号，以及通过不同的核酸适体修饰，实现了对HepG2和A549细胞系的模式识别，为癌细胞的高效低背景识别提供了有力手段.

Fig.3 Imaging of CCRF-CEM tumor-bearing mice with sgc8 or cb-sgc8[72]

由于携带亲本细胞中多种不同蛋白，外泌体组分可以作为癌症识别的重要生物标志物［75］.有效的外泌体表面蛋白的检测为早期癌症诊断提供了方向.2017年，Tan等［76］利用核酸适体技术开发出纳米四面体的核酸适体传感器，其灵敏性比单链功能核酸适体传感器提高了100倍，为有效、灵敏地定量肿瘤外泌体提供了可能.

在细胞群中捕获特定的细胞对疾病的诊断至关重要.循环肿瘤细胞（CTC）是从肿瘤扩散到血液的肿瘤细胞，因此CTC的检测对评估恶性肿瘤的转移有重要意义.与外周血中血细胞的数量相比，CTC细胞的数量极低，为其检测带来了挑战.2010年，Tan等［77］开发出DNA核酸适体胶束，与流道装置结合后，可以在生理条件下高效捕获全血样本中的特定细胞.Fang等［30］利用由cell SELEX获得的核酸适体搭建了可有效从外周血中分离非小细胞肺癌肿瘤循环细胞（NSCLC CTC）的纳米器件，该器件在经DNA酶处理后，可以实现NSCLC CTC的释放.

为了提高实际样本中循环肿瘤细胞和核酸适体的亲和力和选择性，Yang等［78］设计了仿生的微流控芯片，其合理的阵列排布设计可利用细胞尺寸选择性和核酸适体-抗原作用实现对CTC细胞的高效捕获.利用金纳米颗粒修饰核酸适体SYL3C（靶标为EpCAM上皮细胞黏附分子），并固定在微米级芯片微柱上可增加核酸适体的捕获效率和稳定性；且通过过量的生物相容性好的谷胱甘肽来破坏Au—S键从而有效释放捕获的CTC细胞.因此，通过CTC计数、基因分析或药物测试，可以为后续准确诊断、个性化用药和疗效评估提供有价值的信息.

Tan等［79］利用DNA逻辑门对细胞不同标志物进行识别分析，并利用杂交链式反应对信号进行放大.此方法可以实现对癌细胞的一站式识别，在生命科学、生物医学设计和精准医疗领域有广阔的应用前景（图4）.

Fig.4 System design and operational mechanism[79]

3 核酸适体直接用于癌症治疗

核酸适体作为治疗药物可以有效靶向血液循环中或者细胞膜上的不同生长因子，从而调节其与受体的相互作用.

核酸适体药物可以抑制靶标分子的生物活性.Janjic等［80］利用SELEX筛选出靶向血管内皮生长因子（VEGF）的核酸适体，并通过进一步修饰得到对VEGF165高亲和性，而对VEGF121和胎盘生长因子（PlGF129）无亲和性的核酸适体，从而特异性地抑制VEGF与其受体结合，进一步调节血管内皮的通透性，为开发抑制血管生成的核酸适体药物提供了可能.Ellington等［81］筛选获得了核酸适体E07，其与表皮因子生长受体（EGFR）亲和性高，可抑制EGFR引发的磷酸化和细胞增殖，为抗癌治疗提供了可能.

核酸适体还被用于刺激某些信号通路［82］.它通过激活不同的蛋白受体，刺激免疫细胞的激活［83］；促进癌细胞的凋亡［84］或抑制癌细胞的增殖［85］.Gilboa等［86］利用SELEX从RNA库中筛选出可与淋巴细胞表面的肿瘤坏死因子（TNF）的协同刺激因子4-1BB因子特异性结合的核酸适体M12-23，该核酸适体可刺激T淋巴细胞增殖活化，通过对T细胞受体（TCR）通路的刺激，在体外和体内实验中均实现了抑制癌细胞生长的目的.

核酸适体类药物在临床转化方面的研究也取得一定进展，目前已开展了几十种核酸适体药物的临床实验［87，88］.2004年，美国食品药品管理局批准通过了用于治疗年龄相关的湿性黄斑病变（AMD）的核酸适体药物哌加他尼（Macugen，pegaptanib），这是第一个被批准商业化的核酸适体药物，进一步推动了核酸适体抗肿瘤药物临床实验的开展［89］.核酸适体药物AS1411的核酸序列中富含鸟嘌呤，易形成四链体，这种独特的结构不但可以抵抗核酸酶降解，还能特异性靶向核仁蛋白抑制癌细胞生长.由于其巨大的应用前景，随后开展了临床Ⅰ和临床Ⅱ试验，验证了其作为新型抗肿瘤药物的潜力［90］.同样进入临床Ⅱ试验的还有Burger等［91］通过化学方法合成的核酸适体NOX-A12，其可以靶向慢性淋巴白血病（CLL）的驱化因子蛋白CXCL12，从而抑制肿瘤内新血管生成，避免肿瘤细胞的增殖和转移，改善肿瘤微环境，为开展有效的协同治疗提供了良好的前景［92］.

4 核酸适体-药物偶联物在癌症诊疗中的应用

化疗作为癌症治疗的传统方式存在诸多问题，如大多数药物缺乏对患病部位的高效靶向性，容易引发一系列的药物副作用.利用化学共价修饰［93］或者物理相互作用将核酸适体与治疗药物连接［94］，利用核酸适体作为靶向分子，可提高药物的投递效率，精准调控不同种类药物的比例，延长药物在血液循环中的半衰期，改善其生物相容性，从而提高治愈率［95，96］.

利用非共价修饰可以使化学药物嵌入到核酸适体中.如2006年，Jon课题组［94］利用靶向前列腺特定膜抗原的核酸适体A10与抗肿瘤药物阿霉素（DOX）形成新的药物运输平台，解决了化疗药物因高剂量产生的毒副作用.

而药物与核酸适体共价结合，形成核酸适体与药物偶联物（Aptamer drug conjugates，ApDC）可进一步提高其稳定性，使药物的释放更加可控，进而降低化疗药物的毒副作用［97，98］.丝裂霉素C作为一种针对消化道癌症的化疗药物，当其脱靶时，会使非作用部位的DNA烷基化，引发其它副作用.Tan等［99］通过设计一系列连接头，合成了核酸适体-丝裂霉素C偶联物，实现了药物在肿瘤微环境还原剂响应下的可控释放.荧光共聚焦表征数据表明，与对照组CpDC（Control sequence drug conjugates）相 比，ApDC能高效地靶向人胰导管胰癌细胞（PL45），随着孵育时间的延长，PL45 ApDC进入PL45细胞的量逐渐增加.从而有效提高了丝裂霉素C对肿瘤细胞的治疗效果.

利用ApDC材料可构建高效给药的程序化平台［100］（图5）.ApDC材料无需复杂的化学合成，可以通过修饰聚合物增加载药量［101］，提高其在生理条件下的稳定性；而通过尺寸的合理调整，可降低药物的肾脏排泄率，延长ApDC材料在血液中的循环时间.

Fig.5 Schematic illustration of nuclease-resistant synthetic drug-DNA adducts as a simple,yet versatile and programmable platform for targeted anticancer drug delivery[100]

为了增强核酸适体在实际应用中的稳定性，Tan课题组［102］开发了环状二价核酸适体.他们利用点击化学把环状二价核酸适体与不同的化疗药物连接，实现了对不同药物比例的精准调节，解决了药物联合肿瘤治疗（DCCT）策略中无法调整药物比例的问题，实现在肿瘤区域精准释药，减少用药剂量，降低了肿瘤对单一药物的抗药性（图6）.

Fig.6 Preparation of circular bivalent aptamer-drug conjugates(cbApDCs)with accurate tunability of drug ratios for drug combination cancer therapy(DCCT)and the basic information of monomeric aptamers[102]

为了评估ApDC材料的安全性，Tan等［103］利用单颗粒示踪技术系统地研究了细胞摄入ApDC过程中的相关机理.实验结果证明ApDC主要通过小窝蛋白介导的内吞，沿着细胞骨架形成微管和微丝转运到靠近细胞核的酸性核内体中.其中，核酸适体在ApDC内吞方式中发挥关键作用，为ApDC在癌症靶向治疗提供了基础支撑.

5 核酸适体-纳米材料复合探针在癌症治疗中的应用

纳米材料主要分为无机材料和有机材料，如二氧化锰纳米材料、有机金属框架纳米材料及贵金属纳米材料等.纳米尺度赋予材料高活性、大比表面积和超小的尺寸等优势，从而克服了传统材料的限制，被广泛应用于生物医学领域，尤其是癌症治疗新方法的开发.由于实体瘤独特的血管脉络系统的高通透性和滞留效应（EPR），纳米材料能够非特异性地聚集在癌组织.但EPR效应的被动靶向效率较低，需要靶向分子的进一步修饰［104～106］，使纳米材料锚定在肿瘤微环境、细胞膜表面、细胞内溶酶体和核酸受体位点等部位.

5.1 传统无机材料作为载体

传统的无机纳米材料主要包括磁性纳米材料、贵金属纳米材料、碳材料、介孔硅材料和有机金属框架等.它们具有优异的物理化学性质和稳定性，通常具有荧光成像、光热成像和拉曼成像的能力，在光动力学治疗、化学动力学治疗和光热治疗等方向被广泛应用.其中，介孔硅材料因具有肿瘤微环境响应开关的性质，常被用于实现药物可控释放的载体.金纳米颗粒作为最常见的无机纳米材料，具有高稳定性和良好的生物相容性.Chen等［107］合成了一种内层为金纳米棒，外层为稳定的荧光碳层的高生物相容性的核壳结构复合材料，通过核酸适体AS1411的靶向修饰和化疗药物的装载，同时实现了对肿瘤细胞的成像与治疗.Li等［108］将卟啉有机金属框架作为载体，解决了光动力治疗中光敏剂水溶性差和因团聚引起的自猝等问题.核酸适体通过磷酸末端标记在Zr有机金属框架（Zr-MOF）表面，进一步提高其靶向能力，实现了有效的生物成像和光动力治疗（图7）.

肿瘤响应型材料能在肿瘤处可控释药，降低化疗药物的副作用.将阿霉素（DOX）封装在介孔硅中，用多酚包覆后修饰上Sgc-8核酸适体，合成了响应型材料，其可在正常生理状态下可稳定存在，在肿瘤弱酸性微环境和肿瘤细胞内GSH高浓度时可以降解，进而释放药物引起肿瘤细胞的凋亡.该靶向释药的药物递送系统具有易合成修饰、生物相容性好及可实现药物在外部刺激后的可控释放等优点，在肿瘤治疗中有较好的前景［109］.

Fig.7 Illustration of phosphate-terminal DNA aptamer conjugation to a Zr-MOF nanoparticle quencher for target-induced imaging and photodynamic therapy[108]

5.2 有机纳米材料作为载体

虽然无机纳米材料有良好的治疗效果，但其在生物体内循环可能对肿瘤细胞迁移和转移造成影响［110，111］.而有机纳米材料，如囊泡，可以显著降低由材料引起的不必要的炎症，具有更好的生物相容性.外泌体作为细胞与细胞之间信息传递的天然囊泡，被应用于药物诊断和治疗中.Qiu等［112］利用二酰基脂质-核酸适体功能化的外泌体实现了对特定细胞的药物投递并对其内吞机理进行了探究，提供了新型、有前景的抗肿瘤药物递送平台.

光响应的纳米材料作为一种理想载体可以实现药物的精准传递.然而，由于存在缺乏靶向、固有毒性和药代动力过于缓慢等问题，限制了其在临床领域的应用.Tan等［113］将核酸适体与光响应聚合物结合，通过自组装形成具有主动靶向能力的纳米颗粒，在紫外光照射后这些颗粒可以快速解聚，从而实现药物的可控释放.体外细胞实验结果进一步表明该纳米材料可以选择性杀死癌细胞.

药物前药可以作为疏水部分，协助其形成纳米囊泡［114］（图8）可以智能化解决现阶段化学动力学治疗（通过把内源性的过氧化氢转化成自由基，打破肿瘤微环境中的自由基平衡从而有效的抗击癌症）中存在的对酸性环境的过于依赖、微环境中过氧化氢不足及肿瘤细胞内还原性物质如谷胱甘肽偏高等问题.这种新型的纳米材料利用生物正交反应产生自由基，体外实验数据初步证明通过合理化设计可实现该目的.

Fig.8 Schematic illustration of bioorthogonal ApPdC micelles for self-circulation and in-situ amplified generation of toxic free radical in cancer cells[114]

6 总结与展望

本文介绍了核酸适体作为一类具有靶向特定生物标志物的功能核酸材料在癌症的诊断与治疗领域中的相关研究进展.（1）核酸适体作为治疗药物，已对其治疗效果和生物毒性开展了相关的临床研究.（2）核酸适体作为捕获分子，通过进一步修饰影像分子，实现了肿瘤分子探针的构建，提高了复杂体系下肿瘤标志物的筛查能力，为搭建早期筛查平台提供可能.（3）利用核酸适体作为靶向分子，提高药物和纳米材料的主动靶向能力，降低了药物的毒副作用和纳米材料对正常器官的损伤.

尽管核酸适体作为治疗剂或靶标分子，为癌症的早期筛查或相关治疗提供了巨大的帮助.但随着研究的深入，实现核酸适体真正的临床转化仍面临许多挑战：（1）利用技术层面，可进一步优化筛选方式，获得更高效的核酸适体.（2）在生理条件下抵抗酶切反应，保持其生物活性；延长药代动力学的半衰期；增强磷脂双分子层跨域，到达细胞内部与转录因子等生物分子作用.（3）核酸适体-药物偶联物的生物特性和安全性需要进一步深入研究.（4）活体实验中，核酸适体作为靶向分子如何进一步提升纳米颗粒主动靶向的能力，避免大量的纳米材料在正常器官中富集.（5）如何利用核酸适体构建不同的智能化诊疗平台，真正实现癌症治疗效果的最大化.我们希望技术的革新、材料的发展和机理的完善能使这些问题得到充分的解决，使基于核酸适体的诊疗体系为癌症患者带来福音.