重金属镉影响下油松外生菌根的形态特征

计宏蕊,张梦瑜,王晓娜

(河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000)

菌根是由土壤中的菌根真菌与植物根系形成的共生体，这种共生关系在自然界普遍存在，是植物与真菌共同进化的产物。国外对菌根的研究始于19世纪。2004年，Agerer等建立了一个专门进行外生菌根(ECM)形态特征描述和鉴定的网站，并在网上提供用于形态鉴定的软件[1]。我国最早于20世纪70年代开始ECM研究，虽然研究起步晚，但是发展很快。尤其是近几年，随着新兴科技和研究方法不断应用于菌根学研究，我国在此领域取得的成果不断涌现。马大龙[2]通过对赤松外生菌根宏观和微观形态特征观察，把赤松的外生菌根划分为24个种类；张文泉[3]采用形态解剖学与分子生物学手段相结合的方法，对与樟子松共生的外生菌根真菌多样性进行了全面调查及研究，发现有19种真菌能与樟子松形成ECM，表明了樟子松外生菌根的多样性比较高；魏杰[4]将30多年来对油松外生菌根真菌的调查结果进行了总结，列举了20个科，27个属的真菌。龙东风[5]详细描述了油松常见的27种形态型的菌根形态并对部分EMC进行了分子鉴定。

菌根与宿主植物互惠共生，宿主植物为真菌提供其生长所需的营养物质,菌根真菌也在宿主植物生长过程中发挥着重要作用[6]。例如，菌根可以提高植物对土壤矿质营养元素及水分的吸收和累积、促进植物的抗旱、抗涝、抗盐、抗病等。另外，外生菌根真菌能够通过分泌有机酸、糖类、蛋白质等大量有机物来固持重金属，阻止过量的镉进入植物体内，同时也减少土壤中镉的含量。

油松树姿苍劲、态美古雅、四季苍翠，是园林绿化中的优良观赏树种，也是具有传统种植文化的园景树种，可孤植或散植于草地上、路边、向阳坡地，作园林景观赏树种，应用于公园、居住区、校园、街道、广场、机关单位等众多项景观项目中。当镉对油松产生毒害作用时，首先会表现在油松根部的形态和生理功能的变化上[7]。为适应胁迫环境，根系会改变其形态和分布。

近年来，我国农业化肥和农药的使用，工业废水的不合理排放都导致了土壤污染的加剧[8]。油松是深根性树种，生长速度中等、适应性强，是典型的菌根树种，也是北方常见的常绿树种，具有较高的生态效益和经济价值。面对土地资源污染严重又急需增大绿化面积的困境，利用油松对污染的土壤进行生态修复，为缓解土壤污染带来了一丝光明。黄艺[9]研究了外生菌根真菌对重金属铜镉污染土壤中油松生长和元素积累分布的影响；张英伟[10]研究了Cu和Cd胁迫下接种外生菌根真菌对油松根际耐热蛋白固持重金属能力的影响。然而重金属胁迫与油松外生菌根的生长以及菌根的形态结构方面的研究并非完全成熟，尤其是菌根形态与侵染真菌类型的确定这一方面，还需要学者进行进一步的探索。本研究以人工培育的油松幼苗为试验材料，对盆栽基质依次施加NH4NO3、KH2PO4、CdCl2，研究重金属Cd胁迫下油松外生菌根的形态结构，为菌根形态鉴定提供新的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试验材料为2 a生盆栽油松。试验于2019年12月在河北农业大学园林与旅游学院实验室进行。

1.2 试验处理

本次试验采用盆栽处理，透光po膜搭建雨棚，为防止雨季降水对施肥和重金属处理产生干扰。试验场地全部铺设塑料布，每个花盆下设有托盘，防止试验过程对试验地土壤造成污染。试验采用不同浓度氮(N)、磷(P)、镉(Cd)进行处理。N、P处理主要依据河北全年N、P沉降量，并集中在生长季进行模拟，共分10次进行施加。N处理设3个浓度水平，每年0 kg/hm(对照)、50 kg/hm、100 kg/hm；磷(P)设2个浓度梯度每年0 kg/hm(对照)、50 kg/hm；Cd处理采用土壤施加，根据土壤重金属背景值设定3个处理水平:0 mg/kg(对照)、50 mg/kg、100 mg/kg；每个处理4盆重复，共计72盆。

处理以水溶液形式进行施加。称取CdCl2加入水中，每盆施加1 L的CdCl2水溶液。Cd处理时间为2019年7月21日，氮(N)处理采用硝酸铵(NH4NO3)融于水进行添加。磷(P)处理采用磷酸二氢钾(KH2PO4)和氯化钾(KCl)水溶液进行添加。

1.3 测定指标

侵染率：侵染率(%)=被侵染的根段数/观察总根段数×100%；它表明根系对镉的抗性。

菌根类型百分比：菌根类型百分比(%)=某一类型的菌根/总的菌根类型×100%。用土钻钻取试验油松盆中土壤，采用根系扫描仪(万深LA-S)对油松根系进行扫描测量。上层根系直径：样本中，距土壤表面10 cm以内土层中根系的直径。

上层根系表面积：样本中，距土壤表面10 cm以内土层中根系的表面积。

上层根系体积：样本中，距土壤表面10 cm以内土层中根系的体积。上层根大于2 mm根长样本中，距土壤表面10 cm以内土层中根长大于2 mm的根长。

1.4 数据分析

试验所测数据用Excel 2016和SPSS 16.0进行数据整理与分析。

2 结果与分析

2.1 油松外生菌根形态类型

在体式显微镜下，白色背景上观察样品，记录每个根段上根尖数目和未被侵染的根尖数目，便于进行侵染率的核算。观察ECM的宏观特征，如ECM形状、颜色、大小，分支末端形状，菌丝套表面质地等特征，拍照并记录特征，根据形态特征将ECM根尖归类。

最终，从本试验油松材料中采集72份油松菌根，一共观察了288个油松根尖，包括1 478个菌根根尖，总的菌根侵染率为78.1%。油松ECM呈现出各种各样的形态类型，菌根形状主要表现为单轴状、二叉分支、多叉分支、珊瑚状等；菌根颜色也是多样，主要有黄褐色、深褐色、褐色、近黑色、淡黄色、黄色等，不同类型的菌根大小也存在差异。

T1型见图1：菌根颜色为红棕色，一般多为单轴，菌根基部棕褐色，向顶部逐渐过渡为棕红色，表面有少量外延菌丝，菌根较大，菌根类型百分比为11.2%。

图1 T1型外生菌根Figure 1 Type 1 of ECM associated with P. tabuliformi

T2型见图2：菌根颜色为红棕色，一般为二叉分支，少数多叉分支，顶部淡黄透明状，表面光滑无或少菌丝，菌根类型百分比为1.5%。

图2 T2型外生菌根Figure 2 The pictures of the type 2 of ECM associated with P. tabuliformi

T3型见图3：菌根颜色为棕色，一般为二叉或多叉分支，少单轴，菌根顶部为淡黄色，表面光滑，无菌丝，菌根类型百分比为0.7%。

图3 T3型外生菌根Figure 3 Type 3 of ECM associated with P. tabuliformi

T4型见图4：菌根颜色为淡黄色，二叉或多叉分支，有外延菌丝，菌根类型百分比为1.5%。

图4 T4型外生菌根Figure 4 Type 4 of ECM associated with P. tabuliformi

T5型见图5：菌根颜色为黄色，单轴表面少量外延菌丝或无，菌根类型百分比为6.4%。

图5 T5型外生菌根Figure 5 Type 5 of ECM associated with P. tabuliformi

T6型见图6：菌根颜色为黄色，珊瑚状，外延菌丝较多，形如棉絮，菌根类型百分比为0.3%。

图6 T6型外生菌根Figure 6 Type 6 of ECM associated with P. tabuliformi

T7型见图7：菌根颜色为浅黄色，珊瑚状分支，稍透明；有外延菌丝，菌根类型百分比为0.2%。

图7 T7型外生菌根Figure 7 Type 7 of ECM associated with P. tabuliformi

T8型见图8：菌根颜色为黄褐色，单轴或多叉分支，表面有外延菌丝，菌根类型百分比为10.8%。

图8 T8型外生菌根Figure 8 Type 8 of ECM associated with P. tabuliformi

T9型见图9：菌根颜色为黄褐色，二叉状分支，有少量外延菌丝，菌根类型百分比为2.3%。

图9 T9型外生菌根Figure 9 Type 9 of ECM associated with P. tabuliformi

T10型见图10：菌根颜色为黄褐色，单轴，表面光滑无或少量菌丝，菌根类型百分比为10.9%。

图10 T10型外生菌根Figure 10 Type 10 of ECM associated with P. tabuliformi

T11型见图11：菌根颜色为黄褐色，多叉分支，表面光滑，无或少菌丝，菌根类型百分比为2.5%。

图11 T11型外生菌根Figure 11 Type 11 of ECM associated with P. tabuliformi

T12型见图12：菌根颜色为黄褐色，逐渐向顶部过渡为黄色，二叉分支，少单轴分支，表面有外延菌丝，菌根类型百分比为3.4%。

图12 T12型外生菌根Figure 12 Type 12 of ECM associated with P. tabuliformi

T13型见图13：菌根颜色为深褐色，二叉及多叉分支，表面无或少量外延菌丝，菌根类型百分比为2.1%。

图13 T13型外生菌根Figure 13 Type 13 of ECM associated with P. tabuliformi

T14型见图14：菌根颜色为褐色，多叉分支，表面光滑无或少菌丝，菌根类型百分比为1.4%。

图14 T14型外生菌根Figure 14 Type 14 of ECM associated with P. tabuliformi

T15型见图15：菌根颜色为褐色，单轴，表面少量菌丝，菌根类型百分比为5.5%。

图15 T15型外生菌根Figure 15 Type 15 of ECM associated with P. tabuliformi

T16型见图16：菌根颜色为红褐色，单轴，表面光滑无外延菌丝，菌根类型百分比为7.2%。

图16 T16型外生菌根Figure 16 Type 16 of ECM associated with P. tabuliformi

T17见图17：菌根颜色为红褐色，二叉分支，有少量外延菌丝，菌根类型百分比为4.2%。

图17 T17型外生菌根Figure 17 Type 17 of ECM associated with P. tabuliformi

T18型见图18:菌根颜色为红褐色，多叉分支，少数二叉或单轴；有少量外延菌丝，菌根类型百分比为3.3%。

图18 T18型外生菌根Figure 18 Type 18 of ECM associated with P. tabuliformi

T19型见图19：菌根颜色为黄棕色，多叉分支，表面布满菌丝，菌根类型百分比为1.6%。

图19 T19型外生菌根Figure 19 Type 19 of ECM associated with P. tabuliformi

T20型见图20：菌根颜色为深褐色，多叉分支，表面有白色絮状外延菌丝，菌根类型百分比为1.2%。

图20 T20型外生菌根Figure 20 Type 20 of ECM associated with P. tabuliformi

T21型见图21：黄褐色到褐色，二叉状或珊瑚状分支，表面棉絮状，黏附有土粒；分支末端圆钝，淡黄色，菌根类型百分比为4.3%。

图21 T21型外生菌根Figure 21 Type 21 of ECM associated with P. tabuliformi

T22型见图22：菌根颜色为近黑色，多叉分支，先端圆钝，表面光滑或少量菌丝，菌根类型百分比为2.7%。

图22 T22型外生菌根Figure 22 Type 22 of ECM associated with P. tabuliform

T23型见图23：菌根颜色为近黑色，多叉分支，向末端渐细；表面光滑或少量白色菌丝，菌根类型百分比为1.5%。

图23 T23型外生菌根Figure 23 Type 23 of ECM associated with P. tabuliformi

T24见图24：菌根颜色为土褐色，多叉分支，表面有外延菌丝，菌根类型百分比为9.4%。

图24 T24型外生菌根Figure 24 Type 24 of ECM associated with P. tabuliformi

T25型见图25：菌根颜色为透明黄，二叉分支，表面有外延菌丝，菌根类型百分比为1.4%。

图25 T25型外生菌根Figure 25 Type 25 of ECM associated with P. tabuliformi

T26型见图26：菌根颜色为黄褐色，中间横生，表面有外延菌丝，菌根类型百分比为0.7%。

图26 T26型外生菌根Figure 26 Type 26 of ECM associated with P. tabuliformi

T27型见图27：菌根颜色为深土褐色，一般为分叉，密集生长，表面光滑无外延菌丝，菌根类型百分比为0.2%。

T28型见图28：菌根颜色为黄褐色，一般为塔状，表面光滑或少量菌丝，菌根类型百分比为1.6%。

图28 T28型外生菌根Figure 28 Type 28of ECM associated with P. tabuliformi

通过观察发现在Cd浓度为0 mg/kg试验处理下外生菌根的类型有17种，分别为：T1、T2、T4、T5、T6、T8、T10、T11、T13、T14、T15、T18、T20、T23、T26、T27、T28；Cd浓度为50 mg/kg试验处理下的外生菌根的类型有16种，分别为：T4、T5、T8、T9、T10、T12、T14、T15、T16、T17、T18、T20、T21、T22、T23、T25；Cd浓度为100 mg/kg试验处理下的外生菌根类型有13种，分别为：T1、T2、T3、T6、T7、T11、T13、T15、T18、T19、T22、T23、T24；由此可得，随着土壤中Cd含量的增加，外生菌根的类型也在逐渐减少。Cd浓度为0 mg/kg时的处理与其他2组处理之间存在显著性差异(图29)。

图29 菌根类型Figure 29 Mycorrhizal type

2.2 油松外生菌根侵

菌根侵染率见图30。

图30 菌根侵染率Figure 30 Mycorrhizal infection rate

在重金属镉胁迫下的油松根系平均侵染率为78.1%，Cd浓度为0 mg/kg时油松根系侵染率为80.2%；Cd浓度为50 mg/kg时油松根系侵染率为78.5%；Cd浓度为100 mg/kg时油松根系侵染率为75.6%，说明Cd的胁迫会抑制油松外生菌根的生长，降低菌根的生物量。Cd浓度为0 mg/kg时的处理与其他2组处理之间存在显著性差异。

2.3 不同浓度镉对根的影响

将采回的根系样本分为上下2层，本试验主要探究Cd浓度对油松上层根系的影响。

2.3.1 不同浓度镉对上层直径的影响 Cd浓度为0 mg/kg时，施加50 kg/(hm2·a)、100 kg/(hm2·a)N溶液及50 kg/(hm2·a)P溶液后，上层根系直径分别增长了0.47%、6.72%、3.19%。共同施加50 kg/(hm2·a)的N、P溶液后，直径增加了5.29%。且随着施加N浓度的增大效果显著，直径增加了8.42%。

相较于Cd浓度为0 mg/kg时，当Cd浓度上升为50 mg/kg时，上层根系直径总体有所上升。施加50 kg/(hm2·a)的N溶液后，上层直径增长0.39%。与低N溶液处理相比，高N溶液处理增长率提高8.88%、低P溶液处理增长率提高11.29%。共同施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后直径增加了13.12%。提升N溶液浓度后，直径增加16.14%。

相较于Cd浓度为50 mg/kg，Cd浓度为100 mg/kg时上层直径较高。施加50 kg/(hm2·a)、100 kg/(hm2·a)N溶液后，上层根系直径分别增长17.42%、19.90%。低P溶液处理增长率仅为低N溶液处理的0.2倍。共同施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根系直径增加了15.33%。随着施加N浓度的增大效果不显著，直径增加了16.37%。(如图31)

图31 各处理上层根系直径Figure 31 Diameter of upper root of each treatment

2.3.2 不同浓度镉对上层根系体积的影响 Cd的浓度为0 mg/kg时，随着N浓度的增高，上层根体积逐渐增高，分别比对照高1.89%和21.67%。施加50 kg/(hm2·a)P溶液后根系上层体积减小了16.27%。分别施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根系体积增加了8.27%，随着施加N浓度的增大，体积增加了24.81%。

Cd浓度为50 mg/kg任何元素都不施加时，上层根系体积处于最大值。施加50 kg/(hm2·a)的N溶液后，上层根系体积减小了18.55%，当N溶液浓度提高到100 kg/(hm2·a)时，上层体积减小了29.21%。施加50 kg/(hm2·a)P溶液后上层体积减小了27.46%。分别施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，体积减少了33.15%，随着施加N浓度的增大，体积增加了42.01%。

Cd浓度为100 mg/kg，不施加任何元素时，上层根体积处于最大值。随着N溶液浓度的提高，根体积逐渐减少，减少了3.07%和5.16%。施加50

kg/(hm2·a)P溶液后根体积减小了29.34%。分别施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根体积减少了6.27%，施加50 kg/(hm2·a)P溶液和100 kg/(hm2·a)N时，根体积减小了了25.63%。Cd浓度为50 mg/kg、100 mg/kg理与镉浓度0 mg/kg存在显著性差异(图32)。

图32 各处理上层根系体积Figure 32 Root volume of each treatment

2.3.3 不同浓度镉对上层根系表面积的影响 Cd浓度为0 mg/kg时，不施加任何元素，上层根表面积最小。单独施加50 kg/(hm2·a)的N、P溶液后，根面积增加了11.28%、8.33%，当N溶液浓度提高到100 kg/(hm2·a)时，根表面积减小了14.8%；两种低浓度N、P溶液共同处理，根表面积增加了11.75%。高N、低P溶液双重作用下，根表面积增加了14.07%。

Cd浓度为50 mg/kg，不施加任何元素时，上层根表面积最大。施加50 kg/(hm2·a)、100 kg/(hm2·a)N时根表面积减小了6.34%、14.84%；低P溶液处理下根长降低率是低N处理下的2倍。共同施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根表面积减小了14.62%，随着施加N浓度的增大，根表面积减小了19.90%。

Cd浓度为100 mg/kg，不施加任何元素时，根上层表面积最大。施加50 kg/(hm2·a)的N溶液后，根面积减小了12.96%，当N溶液浓度提高到100 kg/(hm2·a)时，根表面积减小了17.10%；施加50 kg/(hm2·a)P溶液后根表面积减小了19.42%。分别施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根表面积减小了21.78%，提升N溶液浓度后，根表面积减小了39.19%。Cd浓度为50 mg/kg、100 mg/kg处理与镉浓度0 mg/kg存在显著性差异。

图33 上层根表面积Figure 33 Root surface area located in the upper layer

图34 根长度大于2 mmFigure 34 The root length greater than 2 mm

2.3.4 不同浓度镉对上层根长的影响 Cd浓度为0 mg/kg时,与空白处理相比，2种不同浓度N溶液处理下上层根长分别增加了5.56%、15.12%。低磷溶液处理下根长增长率是低N处理下的2.5倍。共同施加50 kg/(hm2·a)的2种溶液后，根长增加了25.35%，施加50 kg/(hm2·a)P溶液和100 kg/(hm2·a)N后，根长增加了43.35%。

Cd浓度为50 mg/kg时，该组根长整体小于Cd浓度为0 mg/kg随着N溶液浓度的升高，根长分别增长5.56%、9.34%；施加同浓度低P溶液后根长减小了11.96%。分别施加50 kg/(hm2·a)的两种溶液后，根长减小了13.66%，随着施加N浓度的增大，根长减小了13.20%。

Cd浓度为100 mg/kg时，该组根长整体小于Cd浓度为50 mg/kg施加50 kg/(hm2·a)的N溶液后，根长减小了6.00%，当N溶液浓度提高到100 kg/(hm2·a)时，根长减小了10.11%；施加50 kg/(hm2·a)P后根长减小了14.08%。共同施加低浓度N、P溶液后，根长减小了18.31%；共同施加高N、低P溶液后，根长减小了22.26%。

3 结论与讨论

3.1 结论

与对照(0 mg/kg)相比，中浓度和高浓度Cd处理时，上层根系直径明显增粗，并在高浓度Cd处理下根系直径达到最大，但在Cd浓度为1 000 mg/kg时，N0P0和N0P50直径下降，表明。高浓度镉时，磷的促进作用减小。说明高浓度Cd抑制磷对油松根系生长，但各组间差异性不显著。

Cd浓度为0 mg/kg时，N、P促进根系体积生长并逐渐增大，施加N后使上层根体积呈上升趋势，N0P50时根系体积反而下降，说明低浓度Cd处理下，N的促进作用大于P，且N、P施加可以促进根系体积增大，促进根的生长。中浓度和高浓度Cd处理下，根系体积明显下降。随着Cd的增加，N、P对植物根系体积的作用明显减弱，说明Cd抑制N、P元素对上层根体积的影响。

低浓度Cd处理时，上层根表面积增大，随着N、P元素的增加，根系表面积逐渐增大，而随着Cd浓度的不断增加，土层根系表面积不断减小；当Cd为100 mg/kg时，N100P50在土层根系表面积达到最小值。说明随着Cd浓度的增加，Cd对根系抑制越明显，同时抑制了N、P对根系的生长作用，使得根系表面积减少。上层根长变化与上层表面积变化相似。随着镉浓度的增大，根系上层直径整体呈现增大的状态；根系上层体积、表面积和根长呈现减小的状态。结果可知Cd抑制了N、P对根系的生长，Cd浓度越高，增加N、P浓度对根系的生长影响越大；另外Cd可使根系短缩、增粗的倾向。

3.2 讨论

对上层根系的数据研究，为Cd污染地区油松的抚育栽培(施加N、P)提供了参考。另外，本研究对油松外生菌根的形态进行了观察，并了解到外生菌根丰富的多样性。但同一属真菌形成的外生菌根形态特征有共同点(如菌根颜色、外延菌丝形态、菌套表面组织学特征以及外延结构特征等是由外生菌根真菌自身生物学特征来决定)，甚至有的同种真菌在不同植物上形成形态特征完全相同的外生菌根[11]。同时有关油松外生菌根鉴定的数据还较少，这些因素制约了形态特征在外生菌根分类鉴定上的应用。

本研究只对菌根的形态特征进行分类和描述，并没有根据形态对侵染的真菌进行分类。对侵染真菌的分类还需进一步的分子水平试验。Cd的施加对油松根系具有阻碍作用，能够抑制根系的生长，施加N、P可以促进根系生长。随着Cd浓度的增加使得N、P对根系影响减弱，但N、P可以减少Cd油松根系的毒害作用。Cd的施加能够使上层根系直径增大，所以Cd除了抑制油松根系正常生长的消极影响外，也能使植物根系变粗壮。

目前，有关Cd污染土壤的治理方法有很多，主要有物理方法、化学方法和生物方法等[12]，但这些方法都存在不同程度的缺陷。物理修复要耗费大量资金、人力物力，且移除的污染土壤又容易引起二次污染，难以大面积推广；化学修复容易再度活化重金属；生物修复由于条件限制有一定的局限性。三者综合利用将成为未来土壤污染的主要修复技术，最典型的代表就是近些年发展起来的植物微生物联合修复[13]。植物—菌根联合条件下，菌根与土壤接触面积的扩大和微生物数量的增多为其修复污染土壤提供了良好的条件。目前，关于植物—菌根真菌联合修复重金属污染土壤的研究日益增多，但深层次且兼顾应用的研究依旧匮乏[14]。在国内虽然有这方面的研究但尚不成熟完善，在菌根的发现及鉴定方面仍需进一步研究。