超声造影观察小鼠两种皮下移植瘤的血管生成∗

李爱静 林雪君 尹 玲 寇卜心 柴梦音 陈德喜 刘晓霓 孟繁坤

(1.首都医科大学附属北京佑安医院,北京 100069)(2.北京市肝病研究所,北京 100069)

超声在肿瘤血管生成的评价方面有重要应用,尤其是超声造影技术,大大提高了肿瘤血管的显示率。超声造影所使用微泡造影剂的微泡大小均匀,可以对毛细血管的灌注进行定量分析,评价肿瘤的微血管密度[1],目前临床上常用的SonoVue,其微泡直径与红细胞大小相似,可以进入肿瘤微血管,而无外溢,是一种对血管特定增强显像的造影剂,从而可以对肿瘤血管进行更好地显像[2-3]。我们通过皮下注射建立BT-B膀胱癌细胞和Huh7肝癌细胞移植瘤小鼠模型,应用高频小动物超声的二维灰阶、彩色多普勒和超声造影模式观察两种移植瘤模型小鼠的肿瘤血管情况,并与探头活体激光共聚焦结果和病理结果比较,目的是探讨超声造影观察肿瘤血管生成情况的可靠性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器和试剂

实验动物为雄性 BALB/c裸鼠12只,3～4周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证:SCXK(京)2016-0006,在 SPF级IVC屏障环境下饲养;高频小动物超声成像系统(SSharp prospect,台湾);探头式光纤活体激光共聚焦(Cellvizio Dual Band,法国);BT-B膀胱癌细胞和Huh7肝癌细胞为北京市肝病研究所保存;DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司,磷酸盐缓冲液(PBS)购自赛默飞世尔生物医药技术有限公司;超声造影剂SonoVue(意大利,Brocca公司);戊巴比妥钠粉剂(德国进口分装);CD31单克隆抗体购自Abcam公司;伊文氏蓝购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:BT-B膀胱癌细胞及Huh7肝癌细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100 U/mL、链霉素 100μg/mL)中生长。在 37℃、5%CO2、完全饱和湿度下培养,用 0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代。

1.2.2 建立裸鼠皮下细胞注射移植瘤模型:调整BT-B膀胱癌细胞及Huh7肝癌细胞浓度均为8×106个/mL,均取0.2 mL皮下接种于裸鼠右侧腋窝处,接种前充分摇匀细胞悬液,每组6只。定期观察裸鼠状态,采用游标卡尺观测瘤体生长情况,记录瘤体的最大长径和宽径,根据公式:长×宽2/2计算肿瘤体积。

1.2.3 小动物超声观测:裸鼠称其体质量,1%戊巴比妥钠以80 mg/kg的剂量麻醉裸鼠并固定于造影操作台上,应用S-Sharp prospect小动物超声成像系统的40 MHz高频率探头对两组裸鼠瘤体进行超声扫描,分别于二维灰阶B超模式下观测肿瘤大小、回声、边界等表现,彩色多普勒模式观察肿瘤彩色血流情况,频谱多普勒模式下观察瘤体血流频谱情况,选取血流信号最丰富且清晰的切面留图。然后将造影剂SonoVue与5 mL生理盐水振荡混合后,取0.2 mL经裸鼠尾静脉迅速团注进行超声造影对比模式观察,并留取动态图像进行存储。选择感兴趣区域(ROI),并绘制ROI曲线图,并对造影结果进行后处理分析得到时间强度曲线(time-intensity curve,TIC),峰值强度(peak intensity,PI)、曲线下面积(area under curve,AUC)、达峰时间(time to peak,TTP)等造影指标。

1.2.4 探头式光纤活体激光共聚焦观测:消毒后打开裸鼠皮肤,用镊子钝性分离并暴露部分肿瘤组织,尾静脉注射1.5%伊文氏蓝0.2 mL,小心拨开肿瘤表面皮肤,用探头式光纤活体激光共聚焦的探头对肿瘤血管进行观测。

1.2.5 病理结果:颈椎脱臼法处死小鼠,完整剥离肿瘤后用4%多聚甲醛液迅速固定,常规HE染色及CD31免疫组织化学染色,进行肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)计数,并与超声造影结果的指标进行相关性分析。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析,各计量结果均以(±s)表示。超声造影定量参数与MVD计数的相关性采用Pearson直线相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物成瘤情况

所有裸鼠均成瘤,成瘤率100%。各裸鼠状态良好,实验前期体质量均有所增长,实验后期BT-B膀胱癌组(4只)与Huh7肝癌组(6只)出现了体质量下降(图1A、图1D)。BT-B膀胱癌组与 Huh7肝癌组瘤体体积均有显著的增长(图1B、图1E)。在实验终点(最大肿瘤直径1.5 cm),BT-B膀胱癌肿瘤体积中位数为561.65 mm3(最大值 1 056.33 mm3,最小值276.08 mm3)。Huh7肝癌组瘤体体积中位数1 273.18 mm3(最大值2 489.98 mm3,最小值612.33 mm3)(图 1C、图 1F)。

图1 荷瘤小鼠体质量和肿瘤生长生长情况注:A:BT-B膀胱癌组体质量随时间变化图;B:BT-B膀胱癌组瘤体体积随时间变化图;C:BT-B膀胱癌组平均瘤体体积随时间变化图;D:Huh7肝癌组体质量随时间变化图;E:Huh7肝癌组瘤体体积随时间变化图;F:Huh7肝癌组平均瘤体体积随时间变化图Fig.1 Body weigh t and tum or grow th of tum or bearing m iceNote:A:body weight of BT-B bladder cancer with time;B:volume of tumor of BT-B bladder cancer with time;C:average volume of tumor of BT-B bladder cancer with time;D:weight of Huh7 liver cancer with time;E:volume of tumor of Huh7 liver cancer with time;F:average volume of tumor of Huh7 liver cancer with time

2.2 超声观测结果

2.2.1 二维灰阶B超模式观测结果:两组皮下移植瘤均表现为圆形或类圆形的不均质回声结节,内部回声不均匀,可见散在点状和片状高回声区及低回声区;BT-B膀胱癌组整体内部回声较Huh7肝癌组回声更低(图 2A、图 2B、图 2E、图 2F)。

2.2.2 彩色多普勒PW模式观测结果:两组皮下移植瘤体内部及周边均可探及血流信号,BT-B膀胱癌组为较多、较粗大条状血流信号,Huh7肝癌组点状和小条状血流信号(图2G、图2H)。BT-B膀胱癌组可探及低速高阻血流频谱,而Huh7肝癌组则几乎探及不到血流频谱(图2C、图2G)。

图2 不同模式下肿瘤声像图注:A、B:BT-B组二维灰阶B超模式图;C:BT-B组PW模式图;D:BT-B组彩色多普勒模式血流图;E、F:Huh7组二维灰阶B超模式图;G:Huh7组PW模式图;H:Huh7组彩色多普勒模式血流图Fig.2 Two dim ensional gray-scale B-ultrasound pattern of tum orNote:A,B:BT-B group;C:PW pattern of BT-B group;D:Color Doppler flow pattern of BT-B Group;E,F:two dimensional gray-scale B-ultrasound pattern of Huh7 group;G:PW pattern of Huh7 group;H:Color Doppler flow pattern of Huh7 group

2.2.3 超声造影CT模式观测结果:成功造影10只小鼠,失败2只,其中 BT-B膀胱癌组5只,Huh7肝癌组5只。超声造影显示两组皮下移植瘤较前均有增强,Huh7肝癌组较BT-B组显示出了更多的微小血管(图3)。根据肿瘤的不同增强表现,Huh7肝癌组为弥漫性不均匀增强,BT-B组为从周边环状或半环状增强并向病灶中心增强。两组皮下瘤超声造影参数结果,见表1。

图3 超声造影观察肿瘤血管内部情况Fig.3 Ultrasound contrast mode to observe the internal condition of tum or b lood vessels

表1 Huh7肝癌组与BT-B膀胱癌组超声造影定量参数Table 1 Quantitative parameters of contrast-enhanced ultrasound in Huh7 hepatom a group and BT-B b ladder cancer group

2.3 探头式活体激光共聚焦观测结果

分别选择Huh7和BT-B组各两只裸鼠尾静脉注射伊文氏蓝进行血管标记,然后用小动物探头激光共聚焦观察,结果显示Huh7肝癌组小血管数量分布紊乱,直径较均匀,BT-B膀胱癌组血管分布呈“分支状”(图4),与超声微泡造影观察的血管特征一致。

2.4 病理结果

图4 探头式活体激光共聚焦观测结果Fig.4 In vivo laser con focal observation results

大体标本观察,Huh7肝癌组肿瘤质软、色暗红,与周围组织粘连较重;BT-B膀胱癌组肿瘤质地较韧、色偏白,与周围组织较容易分离。切开肿瘤组织,Huh7肝癌组较容易切开,瘤体松软,出血较多;而 BT-B组肿瘤较难切开,瘤体较硬,出血较少(图5A～图5D)。镜下观察,Huh7组与BT-B组肿瘤细胞增生明显,细胞分裂像多,核大、核深染(图5E、图5F),免疫组化结果显示Huh7组血管较BT-B组分布杂乱(图5G、图5H),BT-B膀胱癌组肿瘤MVD(19.56±1.47),Huh7肝癌组肿瘤MVD(30.67±6.80)。

2.5 超声造影参数与M VD相关关系分析

分析超声造影各项参数与MVD关系,结果显示峰值强度 PI与 MVD相关性好(r=0.844,P=0.034),呈正相关,P＜0.05(图 6)。

图5 病理结果注:A、B、C、D:两组瘤体的大体标本 E、F:两组 HE染色结果(×400)G,H:CD31染色结果(×200)Fig.5 Pathological resultsNote:A,B,C,D:gross specimens of two groups of tumors E,F:HE staining results of two groups(×400)G,H:CD31 staining results of two groups(×200)

图6 超声造影各参数与M VD关系图Fig.6 Relationship between parameters of contrast-enhanced ultrasound and M VD

3 讨论

肿瘤的血管生成一直是肿瘤生长和转移的关键过程,且与预后密切相关[4-5],所以对肿瘤血管生成的评价至关重要。肿瘤血管生成情况通常用微血管密度(MVD)来表示,是在高度血管化的肿瘤区域使用CD31的免疫组织化学测定用来评估,这也是目前公认的“金标准”。然而,这是一种有创性检查方法,并且由于受操作者操作水平、取材的部位、患者本人配合等因素的影响容易出现测量误差[6]。所以,如何无创且对肿瘤进行准确而全面的评估显得至关重要。

本研究通过建立两种细胞移植瘤模型,观察两种肿瘤在不同超声模式下的影像特征。发现在彩色多普勒模式下BT-B组肿瘤血流信号虽然较Huh7组肿瘤多,然而在进行超声造影后,Huh7组显示了更多的微小血管,BT-B组在原有基础上显示出的微血管相对较少。其原因可能是:(1)Huh7组以微小血管为主;(2)虽二者均为肿瘤组织,新生血管较正常组织多,但肿瘤血管的空间分布不同,Huh7组肿瘤微血管的空间分布更加纤细、紊乱;而BT-B组则为较大血管逐级向下一级分支,呈“分支状”排列;(3)可能与所选取的肿瘤切面有关,没有切到最能代表肿瘤血管生成情况的切面。此外,研究样本数量较少,受裸鼠个体差异所导致的结果偏差可能较大。另外,在造影观察期间,因麻醉及裸鼠呼吸抖动等影响,会造成图像抖动,对结果也有一定影响。

我们通过对两种皮下移植瘤的观察发现:超声造影对肿瘤血管分布的显示与病理和活体激光共聚焦结果契合性好。Xing等[7]研究表明超声造影结果与病理结果一致性较好,且 PI是目前与病理MVD相关性最好的一个超声造影参数,这已经被众多学者的研究结果证实[8-10]。我们的结果也显示PI与MVD的相关性良好,呈正相关,可以作为提示肿瘤血管增殖情况的重要指标。所以,超声造影模式可以作为无创评价肿瘤血管生成的可靠方法。