复方黄芪颗粒的质量标准研究

★ 张玉爱 张礼芳 李昕颖,2 郭智强 廖太祥（.南昌市博泽康医药科技有限公司 南昌330029；2.南昌大学 南昌 330029）

复方黄芪颗粒的处方由防风、金银花、首乌藤、黄芩、黄芪、薏苡仁等16 味中药材组成，其主要功效为益气渗湿，清热凉血，用于治疗风湿热相搏，客于肌肤之湿疹、玫瑰糠疹、药物性皮炎、接触性皮炎、多形红斑、结节性红斑等病症。原中药处方没有固定的质量标准，很难对药品质量进行控制，为了有效在临床中安全的应用和推广，因此有必要进行相关的医院制剂质量标准研究。

本文对该颗粒进行质量标准研究，通过TLC法对处方中的首乌藤、黄芪和黄芩进行定性鉴别，并以黄芩苷为定量指标，用HPLC 法测定该成分的方法并进行方法学考察，最终建立了复方黄芪颗粒的质量标准，保证临床用药的安全、有效和稳定。

1 仪器与材料

1.1 仪器KQ2200DB 型超声波清洗机（昆山超声波仪器有限公司）；ZF-2 型紫外仪（上海安亭电子仪器厂）；BS25S 型电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司，d=0.01 mg）；LC-10AT 型高效液相色谱系统（日本岛津公司）；硅胶G 板（青岛海洋化工厂）。

1.2 材料大黄素对照品（批号：110756-200110），黄芪甲苷对照品（批号：110781-201717），黄芩苷对照品（110715-200815），以上均购自中国药品生物制品检定研究院。首乌藤是蓼科植物何首乌的干燥藤茎；黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根；黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。复方黄芪颗粒供试品三批（170508、170511、170514）及阴性样品均由本公司自制。甲醇为色谱纯；水为超纯水（自制）；其它化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 首乌藤的薄层色谱鉴别首乌藤中的主要化学成分为大黄素［1］。①供试品溶液的配制：取本品20 g，研细，加硅藻土5 g，研匀，加盐酸和水各5 mL，搅匀，再加乙酸乙酯50 mL，振摇15 min，超声处理45 min，取出，滤过，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。②对照品溶液的配制：另取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。③阴性溶液的配制：取缺首乌藤药材的复方黄芪颗粒内容物20 g，按供试品溶液制备的方法制成首乌藤阴性对照品溶液。④薄层色谱鉴别条件：照2015 版《中国药典》薄层色谱法（第四部通则0502）试验［2］，使用定量点样毛细管吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯－甲酸（60∶20∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于日光灯下检视。⑤结果：供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照溶液色谱无上述斑点检出。说明本法专属性强，可以作为首乌藤的鉴别。

图1 首乌藤薄层鉴别图谱

2.1.2 黄芪中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别黄芪中的主要化学成分为黄芪甲苷［3］。①供试品溶液的配制：取本品10 g，研细，加甲醇40 mL，加热回流1 h，滤过，滤液加在中性氧化铝柱（100～120 目，10 g，内径为10-15 mm）上，用40 %甲醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30 mL 使溶解，用水饱和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用20 mL 水洗涤2 次，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。②对照品溶液的配制：另取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。③黄芪阴性对照溶液的配制：再取缺黄芪药材的复方黄芪颗粒内容物10g，按供试品溶液制备的方法制成阴性对照品溶液。④检查方法：照2015 版《中国药典》薄层色谱法（第四部通则0502）试验［2］，使用定量点样毛细管吸取上述对照品溶液2 μL，供试品溶液10 μL，阴性对照品溶液10 μL 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰。⑤结果：在紫外365 nm 下检视，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照溶液色谱中，无上述斑点检出。说明本法专属性强，可以作为黄芪的鉴别。

图2 黄芪薄层鉴别图谱

2.1.3 黄芩中黄芩苷的薄层色谱鉴别黄芩中的主要化学成分为黄芩苷［4］。①供试品溶液的配制：取本品10 g，研细，加5 %甲酸甲醇溶液30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，用20 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。②对照品溶液的配制：另取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作为对照品溶液。③黄芩阴性对照溶液的配制：再取缺黄芩药材的复方黄芪颗粒内容物10 g，按供试品溶液制备的方法制成阴性对照品溶液。④检查方法：照2015 版《中国药典》薄层色谱法（第四部通则0502）试验［2］，使用定量点样毛细管吸取上述供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，阴性对照品溶液10 μL 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液。⑤结果：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；阴性对照品溶液色谱中，无上述斑点检出。说明本法专属性强，可以作为黄芩的鉴别。

图3 黄芩薄层鉴别图谱

2.2 黄芩苷的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验［2］色谱条件：岛津高效液相色谱仪；PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶53）；柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样量为10 μL。在此色谱条件下，供试品中的黄芩苷与其他成分有较好的分离度，阴性样品对指标成分含量测定无干扰。

图4 高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取适量的黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含黄芩苷约40 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70 %乙醇溶液20 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70 %乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备按处方比例，称取缺少黄芩的复方黄芪颗粒的药材，按照制备工艺配制，然后依照“2.2.3”项下的方法制备阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系考察精密称取黄芩苷对照品45 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.9 mg/mL 的对照品贮备液。再分别精密吸取对照品贮备液0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液，分别进样10 μL，按以上色谱条件测定，记录色谱图，以测定浓度X（mg/mL）对峰面积Y进行线性回归，得回归方程为Y=4×106X-6 476.5，r=0.9999（n=7），试验结果表明黄芩苷在0.045 69 mg/mL～0.913 9 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验精密吸取同一对照品溶液10 μL,按照“2.2.1”项下色谱条件，重复进样6 次，记录峰面积，结果对照品溶液峰面积RSD=0.31%（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验分别精密称取同一批样品约1 g（批号170508）6 份，按照供试品溶液制备方法制备，依法测定样品中黄芩苷的含量，结果6 份黄芩苷的含量分别为1.303，1.320，1.327，1.311，1.315，1.319 mg/g，平均含量为1.316 mg/g，RSD为0.62%（n=6），表明该方法在同一条件下重复性好。

2.2.8 稳定性试验取装量差异项下的本品内容物（批号：170508）约1.0g，精密称定，按照“2.2.3”项下方法制备供试液，室温放置，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分别吸取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。结果峰面积的RSD 为0.25%，表明24 h 内供试品溶液稳定。

2.2.9 加样回收率取同一批次项下的颗粒，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入黄芩苷对照品溶液（0.507 1 mg/mL）1 mL，按含量测定方法项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液进行测定，平行6 份，计算回收率。

表1 黄芩苷回收率试验结果

2.2.10 样品含量测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算3 批中试样品含量，三批中试样品（170508、170511、170514）含量分别为1.331 mg/g、1.352 mg/g、1.313 mg/g。

3 讨论

3.1 专属性考察本试验对处方中的金银花、黄连、首乌藤、黄芪和黄芩等进行了薄层鉴别条件摸索，发现在本实验色谱条件下，金银花、黄连等均有阴性干扰，首乌藤、黄芪和黄芩供试品色谱与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同的颜色斑点，阴性样品无干扰。因此确定了首乌藤、黄芪和黄芩作为薄层鉴别方法，重现性好，结果可靠。

3.2 检测波长的选择采用二极管阵列检测器对黄芩苷对照品色谱峰进行光谱扫描，结果黄芩苷在280 nm 波长处有最大吸收，由于280 nm 杂峰对目标峰干扰少且稳定，故选择280 nm 作为检测波长。

3.3 提取方法的选择对加水量、提取时间、提取次数进行了摸索及确定，进行了三因素三水平正交实验，结果表明，提取次数对提取工艺影响最大，其次是加水量，提取时间对提取工艺影响较小。从经济成本、实际生产考虑，确定本品提取最佳工艺条件为：加水量为8 倍，提取时间为2 h，提取次数为2 次。

3.4 制剂工艺的选择日常生产过程中，中药颗粒剂一般采用蔗糖作为矫味剂，糊精、淀粉作为粘合剂，我们分别对其进行了考察，并以溶化性作为参考依据，结果发现蔗糖加糊精，溶化完全，无分层现象；蔗糖加淀粉，溶化性不好，出现少量分层现象。故根据实验结果，采用蔗糖、糊精作为制剂成型辅料。

3.5 色谱条件的优化本实验通过摸索乙腈与0.2 %磷酸水溶液、甲醇与0.2 %磷酸水溶液以及甲酸与0.2 %磷酸水溶液按一定比例混合作为流动相，考察其分离度，结果以甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶55）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃、PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）的色谱条件下供试品中黄芩苷与其他共存组分峰能达到良好的分离。

本实验建立了复方黄芪颗粒中黄芩苷的HPLC含量测定方法。结果表明，所建立的方法操作简便、结果可靠、重复性好。