结核病的分子诊断——进展与挑战

李俊明，徐炜

（1.南昌大学第一附属医院检验科；2.江西省医疗服务指导中心，江西 南昌 330006）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb） 感染导致的一种严重危害人类健康的感染性疾病。世界卫生组织（WHO）最新的研究报告显示，尽管结核病疫情已得到一定的遏制，全球每年仍有约1000 万的新发病例, 约100-140万人死于结核病。尤其值得警惕的是，结核病的耐药形势日益严峻。目前, 大约3.3%的新发病例和17.7%的经治复发病例为耐多药结核病（即同时对利福平和异烟肼耐药）[1]，而研究显示，相对于初治和非耐多药的复治结核病患者83%的治愈率，耐多药结核病和广泛耐药结核病治疗的成功率显著降低，分别为54%和30%[2]。

早期发现结核病患者并给予有效的治疗是控制结核病疫情的关键环节。目前，结核病的诊断主要基于临床表现、影像学检查和实验室检查。由于结核病,尤其是肺外结核的临床表现和影像学特征均不是很典型,实验室检查在结核病的诊断中发挥重要作用。目前，结核病诊断和药敏分析应用最广泛的方法仍然是细菌学方法,主要包括痰涂片抗酸染色和结核分枝杆菌培的培养。痰涂片抗酸染色的敏感性差,且无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。培养法的敏感性较痰涂片抗酸染色有显著提高，但耗时过长，一般需要3～4 周获得阳性结果, 如果加上药敏分析的时间通常需要6～8 周时间。细菌学检查的这些不足极大地限制了结核病的及时诊断和药敏分析。WHO 估计，目前全球每年约有300 万的结核病患者因未获得诊断而被遗漏[1]，而且，即使在获得细菌学确诊的结核病患者中也仅有三分之一进行了药敏分析检测,大多数患者接受的是经验性的治疗。因此，快速而准确的结核病诊断新技术的开发和应用对于结核病的诊断和治疗,以及全球结核病疫情的防控均具有重要意义。

近年来,分子生物学技术的快速发展给结核病的早期诊断和快速药敏分析产生了巨大的推动作用,一系列新的分子诊断技术正在或即将进入临床应用。目前，已有多种分子诊断平台经过了WHO的论证并获得WHO 的推荐，另外还有多种新近发展的分子诊断平台虽未获得WHO 推荐但已经获批在临床应用,这些分子诊断技术的发展和应用有望进一步增强结核病的临床诊断和药敏分析能力，同时大大缩短检测时间，促进结核病的早期诊断和合理治疗。

1 基于核酸扩增试验的结核病诊断及药敏分析技术

基于核酸扩增试验 （nucleic acid amplification tests, NAATs) 的结核病诊断技术是指通过聚合酶链式反应技术 （polymerase chain reaction, PCR)对结核分枝杆菌复合群的特异性基因序列或耐药相关基因进行靶向扩增和分析,借以对结核病进行诊断和耐药性分析的技术。NAATs 最主要的特点是具有很高的检测敏感性，同时检测速度快，是目前应用最为广泛的结核病分子诊断技术。

1.1 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra 系 统Xpert MTB/RIF 检测系统以Mtb 的rpoB 基因为靶标, 通过荧光定量PCR 技术进行特异性扩增后采用分子信标技术对其中与利福平（rifampicin，RIF）耐药相关的突变位点进行检测,从而同时实现对M tb 进行检测和对RIF 耐药基因型进行分析[3]。Xpert的主要特点是具有良好的检测敏感性和特异性，同时具有操作简便、检测时间短和生物安全性好等优点,也因此于 2010 年获得了 WHO 的推荐[4]。大量的研究显示，Xpert MTB/RIF 对结核病诊断的整体敏感性和特异性分别达85%和98%,对于痰涂片抗酸染色阴性标本的检测敏感性也可达到70%,同时其在RIF 耐药性分析方面也具有优秀的表现，敏感性和特异性分别达96%和98%[5-7]。然而也有研究显示, 在结核病疫情低发的国家和地区,Xpert MTB/RIF 检测的敏感性并不理想[8]。

为了进一步提高检测的敏感性，美国 Cepheid公司推出了第二代Xpert 检测系统,即Xpert Ultra。Xpert Ultra 采用了更大的 DNA 扩增仓和两个额外的分子靶标（IS6110 和 IS1081）来检测 Mtb，同时将高分辨融解曲线分析技术应用于RIF 耐药基因型的检测, 从而进一步提高了其检测的敏感性,使其最低检测限达到16CFU/mL, 同时保留了对rpoB 基因突变检测的高敏感性和高特异性[9,10]。研究结果显示，Xpert Ultra 检测Mtb 的整体检测敏感性可达88%, 同时显著地提高了对于儿童结核和HIV 感染者合并结核病的检测敏感性。因此，WHO在2017 年推荐将Xpert Ultra 系统用于成人和儿童结核病的首诊检测,包括HIV 感染合并结核病的诊断[11]。然而，检测敏感性的提高在一定程度上降低了Xpert Ultra 检测的特异性。虽然从整体上来看由此导致的特异性下降并不是很明显 （从98%下降至96%）,但研究证实其对HIV 合并Mtb 感染的患者和结核病复发患者等特定群体的检测性能有较明显的影响,可显著降低其检测的特异性和阳性预测值[12]。

目前 Xpert MTB/RIF 和 Xpert MTB/RIF Ultra系统已在全球数十个国家获得了较广泛的应用,在结核病的诊断和耐药性分析方面发挥了非常积极的作用。然而，Xpert 检测系统的应用也存在一些不足, 除了因检测敏感性问题导致部分漏诊外,在RIF 耐药性分析方面也存在一定程度的假阳性和假阴性结果, 如可能出现因rpoB 基因无义突变造成RIF 假性耐药的结果[13],也可能因Mtb 存在rpoB热点突变区域以外的RIF 耐药相关基因突变而导致假性RIF 敏感的结果[14]。此外,由于大多数对RIF耐药的Mtb 会同时对异烟肼（isoniazid，INH）耐药，因此很多研究者利用Xpert 进行耐多药结核病的检测或推测。然而，有研究显示有约40%对RIF 耐药的患者对INH 是敏感的[15]，在对RIF 敏感的患者中也有约27%的患者对其它一线抗结核药是耐药的[16]。因此，在采用Xpert 系统进行结核病诊断和耐药性分析时应注意其应用的范围。

1.2 基于等温扩增技术的结核病诊断技术 等温扩增技术是一类在恒温条件下进行核酸扩增的技术，根据引物设计方法、采用的聚合酶和解链条件的不同又可分分环介导的等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术、交叉引物扩增（crossing priming amplification，CPA）技术和核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术等。与常规 PCR 比较，恒温扩增具有操作简单、扩增效率高、报告时间短和经济等优点，同时由于不需要经历不同的温度循环，无需复杂昂贵的DNA 扩增仪，非常适合在贫困地区和基层实验室使用[17]。

LAMP 技术是目前唯一通过WHO 的技术验证并获得WHO 推荐应用的基于等温扩增的结核病快速诊断技术,已在多个国家获得了较广泛的应用[18]。LAMP 借助具有链置换功能的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA 聚合酶和至少4 条引物在60～65℃条件下完成DNA 扩增过程,具有极高的扩增效率，可在60 分钟内完成扩增并通过可视化的方式 （荧光或浊度改变等） 呈现结果。WHO 的验证数据显示，LAMP 技术在结核病诊断方面具有良好的敏感性76%～80%和特异性 97%～98%[18]。

其它的一些等温扩增技术虽未经WHO 验证，但已有多种获批在临床上应用,这些技术虽同为等温扩增,但根据引物设计和解链方式的不同各具特点[19]，如基于核酸序列依赖性扩增技术的同步扩增检测系统(Simultaneous amplification and testing,SA T-TB) 以Mtb 特异性的16s rRNA 为扩增靶标，可特异性检测标本中存活状态的Mtb，可有效避免死菌的存在对检测结果的干扰。这一特点对经治结核病患者的准确诊断具有更好的特异性， 且具有监测结核病治疗效果的潜力[20]。

1.3 基于数字PCR 的结核病诊断和药敏检测技术数字PCR(digital PCR, dPCR)是一种新近建立的单分子核酸扩增技术，其原理是将含有DNA 模板的PCR 溶液稀释后分布到大量的独立反应室,使单个的模板DNA 分子在各自独立的反应单元中进行PCR 扩增,再在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。由于各DNA 模板在独立的反应单元中进行扩增，因此dPCR 具有极高的分辨率和灵敏度,同时由于可在不依赖内标的条件下实现绝对定量，dPCR 技术可准确地计算出野生型和突变型基因的比例[21],这些特点使dPC R 在突变基因检出方面具有极佳的性能，可以在耐药相关基因的检测方面发挥独特的作用。

在结核分枝杆菌耐药基因型的判断中,如果在菌群中存在1%以上的菌株同时对INH 和RIF 耐药即可定义为耐多药结核,并在临床中表现出耐多药结核的表型[22]，这种因少数耐药菌存在导致的耐药现象被称为异质性耐药[23]。研究显示，在结核病高发地区有9%～20%的临床分离菌株中存在异质性耐药现象[24]，而现有的核酸分子杂交技术和常规PCR 技术都难以检测到5%以下的突变分子，因此在耐药基因型的检测方面存在一定的局限，而dPCR 可以借助其高灵敏度和高分辨率的优势检出低至0.1%的突变分子。菌株水平的研究证实，dPCR 可检测出低至1CFU/μL 的Mtb, 并可在野生型基因片段中检出低至0.1%的结核病耐药相关基因[25]，表现出极好的检测异质性耐药的性能。应用临床标本对结核病进行肺结核和肺外结核诊断的临床研究也证实，dPCR 具有优于常规PCR 的检测敏感性和特异性[26,27]。研究同时证实，利用dPCR 技术可很好地检出结核病患者外周血中Mtb 的循环游离DNA, 其检测的敏感性和特异性均显著优于常规的荧光定量PCR 技术, 这对于儿童结核病和肺外结核病的诊断具有很好的实用价值,因为这些患者常常无法获取痰标本[28,29]。同时，由于可对标本中的核酸分子进行准确的定量，dPCR 还可用于监测结核病患者的治疗反应性, 从而指导临床的治疗,这对于接受经验性治疗的患者尤其具有重要意义。然而，目前dPCR 在临床中的应用还远未普及，WHO 也还未对该技术在结核病诊断和药敏检测中的有效性组织论证,其中很重要的原因之一可能在于dPCR 检测需要昂贵的设备，检测成本也显著高于常规的NAATs 技术。

1.4 其它NAATs 技术 作为核酸扩增和检测的最主要技术平台，PCR 主要的特点之一就是可以不断的推陈出新,在此基础上衍生出各种具有不同特点的核酸扩增和检测方法,在结核病分子诊断领域也充分展示出了PCR 技术平台的这一特点。近年来，一系列基于PCR 技术的NAATs 检测系统不断地被开发出来并用于结核病的诊断和药敏分析，其中比较具有代表性的包括基于多重荧光定量PCR 技术的 Abbott RealTimeMTB 和 Abbott RealTimeTMRIF/INH 检测系统，基于不对称扩增和线性指数PCR (linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)技术的 Hain FluoroTypeMTB 和 Hain FluoroTypeMTDBR 检测系统， 基于多靶标荧光定量PCR 技术的Roche CobasMTB 系统和PCR扩增结合荧光探针融解曲线分析的MeltProTB检测系统等。这些检测系统大多可以同时进行Mtb检测和药敏分析，而且，与现有的WHO 推荐的方法比较具有更高的检测通量，如Abott RealTime 检测系统每批次可检测96 份标本，且具有良好的检测性能,在Mtb 检测方面的敏感性和特异性分别为96%和97%，检测RIF 耐药性的敏感性和特异性分别为94%和100,检测INH 耐药性的敏感性和特异性分别为89%和99%[30]。2019 年WHO 成立了一个专门的技术小组对这些高通量的分子诊断平台进行相关性能的论证, 初步的结果显示这些平台在Mtb 检测方面的性能与Xpert 相近，在检测耐多药结核病的性能方面与线性探针技术相近， 但技术小组的报告认为目前还未得到足以支持推荐这些检测平台的足够数据[31]，因此尽管上述部分检测系统已经得到相关政府管理部门的批准应用于临床，但主要还局限于科研实验室的应用，但目前，WHO 已计划成立一个指南开发小组对这些技术平台进行第二轮的论证[1]。

2 基于核酸分子杂交技术的结核病药敏检测技术

核酸分子杂交技术是基于具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下可按碱基配对原则形成双链分子的原理,将待检分子与已知序列的核酸分子进行杂交反应,再通过适当的检测技术对杂交产物进行检测和分析的技术。如果在进行杂交反应前对已知序列的核酸分子,即核酸分子探针进行标记即可在杂交反应后对杂交产物进行检测,通过分析与不同探针分子发生杂交后的信号进行分析即可了解待检标本中存在的核酸分子的信息。核酸分子杂交技术最主要的优势是其具有强大的多靶标分析能力,理论上通过设计合适的探针可用于几乎所有突变形式的检测。随着固相载体材料和点样技术的不断发展,分子杂交检测的高度集成的优势越发显著,使得其在核酸分子检测中的效率越来越高。目前，分子杂交技术已广泛应用于各类核酸分子,尤其是突变分子或SNP 的检测与分析。通常，而为了提高核酸分子杂交检测的灵敏度,核酸分子杂交多与PCR 技术结合使用，即首先通过PCR 技术对标本中的待检核酸分子进行扩增,再采用特异性的探针对扩增产物进行杂交分析。

由于结核分枝杆菌的耐药机制绝大多数与染色体核酸分子的突变有关,且绝大多数与Mtb 耐药相关的基因突变类型已经明确,因此核酸分子杂交在Mtb 耐药性检测方面有很好的应用价值,目前已有多种基于核酸分子杂交的技术平台应用于结核病的诊断和耐药分析。早在2008 年，WHO 就推荐采用线性探针分析法(Line probe assay, LPA)对结核病患者进行RIF 和INH 的耐药性检测, 这也是WHO 最早推荐使用的结核病分子诊断技术[32]。线性探针分析法是基于反向杂交的原理, 采用靶向Mtb 23S rRNA 基因的探针进行Mtb 的检测, 采用靶向rpoB 的多条探针检测RIF 耐药相关的基因序列，采用靶向katG 基因和inhA 基因启动子区域的探针检测INH 耐药相关的基因序列。相关的meta分析显示, 对于痰涂片抗酸染色阳性的结核病患者，LPAs 检测RIF 耐药的敏感性和特异性分别为96.7%和98.8%，检测INH 耐药的敏感性和特异性分别为 90.2%和 99.2%[33]。然而，由于 LPAs 对涂阴结核病患者检测的敏感性较差，WHO 仅推荐将LPAs 用于经细菌学方法确诊的患者的耐药性分析。随着Xpert MTB/RIF 技术和其它NAATs 技术的快速发展，目前已很少实验室采用LPAs 进行结核病的诊断和一线抗结核药物的耐药性分析。然而，由于在检测靶标数量方面存在限制，NAATs 技术难以同时对一线和二线药物进行药敏分析，因此新一代的LPAs 技术在对结核病二线药物进行药敏分析方面获得了较好的应用，WHO 也因此再次对LPAs 在结核病药敏分析中的应用进行了论证，并于2016 年推荐其用于对氟喹诺酮和结核病二线注射药物，包括卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素等的药敏分析[34]。然而，由于与二线药物耐药相关的基因数较多,耐药相关的突变位点更多且较分散，即使是LPAs 系统也难以覆盖所有的耐药相关位点，因此对于LPAs 进行二线药物药敏分析的性能，不同系统和不同实验室的数据存在较大差异，因而WHO 也将LPAs 的推荐应用范围局限在广泛耐药患者的筛查中， 即仅用于确诊的耐多药结核或耐RIF 患者的二线药物的耐药性分析。尽管如此，由于可同时检测的靶点多、检测效率高且检测成本较低,基于核酸分子杂交的结核病诊断和耐药检测技术仍获得了较多研究者和临床实验室的青睐, 如基于PCR 扩增和核酸杂交芯片的TruenMTB/MTB-Rif Dx 系统和 GeneChipMDR 系统就分别在印度和中国获批了临床应用， 并分别获得了WHO 和比尔及梅琳达·盖茨基金会结核病项目的技术验证和推广[1,35-36]。

LPAs 一个比较突出的缺点是需要在PCR 扩增后对扩增产物进行杂交检测,操作复杂且存在一定的生物安全和较高的实验室污染风除,操作时间也相对较长,因而在很大程度上限制了这一技术的应用和推广。近年来，随着微流控技术的发展和不断成熟,很多研究者尝试将微流控系统与核酸分子杂交技术相结合建立一种全自动的核酸分子检测系统，以期克服分子杂交操作复杂、生物风险和实验室污染较大的不足,并取得了较好的成果，如基于此原理的TruArray MDR-TB 系统就是通过微流控系统将PCR 扩增、 核酸分子杂交和杂交产物检测的各过程整合进一个平台,从而实现结核病诊断和药敏分析的自动化检测。这一平台以IS6110 and IS1245 基因为靶标进行结核分枝杆菌复合群和鸟分枝杆菌复合群的检测,同时以分别靶向野生型和突变型 rpoB、katG、inhA、embB 和 rpsL 基因的寡核苷酸探针同时进行杂交,实现同时完成Mtb 检测、 一线和二线抗结核药的耐药基因型检测的目的。研究结果显示,其对一线抗结核药物的耐药性检测具有很好的准确性, 其中对INH、RIF 和乙胺丁醇 （EMB） 耐药的检测敏感性分别为90.0%、100%和70%, 特异性分别为98.2%、95.0%和98.6%。由于设计的探针未能完全覆盖链霉素（streptomycin, SM）耐药的相关基因，这一系统对二线药物SM 耐药的检测敏感性较差，只有34.8%，但特异性达到99.2%，与耐药表型的总体一致率也达到了89.5%[37]。其它一些基于微流控和核酸分子杂交技术的检测系统也在陆续地研究开发当中，如Veredus 公司推出的VereMTBTM 系统等， 但目前尚未纳入WHO 的验证范围。

3 基于基因测序的结核病诊断及药敏分析技术

与NAATs 和核酸分子杂交等靶向性的基因检测和分析技术不同,基因测序可提供完整和准确的基因组或特定基因的序列信息,因此也被认为是基因检测和分子诊断的金标准。根据测序原理的不同,目前的基因测序技术主要分为一代测序和二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）。一代测序技术的测序准确率和通量更高, 但测序速度慢，检测敏感性差，尤其是对突变分子检出的分辨率不佳（一般只能检测20%以上的突变分子）,因而在结核病诊断和药敏分析中的应用价值不是很好,目前往往被用作二代测序结果的进一步确认。NGS又被称为大量并行测序或高通量测序,具有测序速度快、检测效率高、敏感性好和突变基因检出分辨率高等特点，已被广泛应用于产前诊断、肿瘤和遗传性疾病的诊断等领域,在感染性疾病的诊断和药敏分析领域也表现出良好的应用价值[38]。根据测序策略的不同，NGS 又可应用于特定微生物种群的全基因组测序 （whole genome sequencing，WGS）和非靶向性的宏基因组测序（Metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。

研究显示,在Mtb 检测方面，WGS 具有与NAA Ts 相似甚至更好的敏感性和特异性， 但在耐药基因型的检测方面明显优于NAATs 技术和核酸分子杂交技术[39,40]。一方面，由于可准确检测Mtb 的全基因组信息，WGS 可以覆盖所有与Mtb 耐药相关的基因和位点，因此对耐药基因型的检测更为灵敏。另一方面,由于可以获得基因详细的序列信息,NGS可避免在NAATs 和核酸分子杂交检测过程中出现的因基因多态性导致的假阳性结果,因此具有更好的特异性, 可用于NAATs 技术和核酸分子杂交技术检测结果的确认[41]。此外，有研究显示，NGS 可从敏感性Mtb 中检出低至3%的耐药Mtb, 因而具有比NAATs 和核酸分子杂交技术更优的Mtb 异质性耐药的检出率[42]。

然而截至目前，WGS 尚未作为常规技术应用于临床结核病的诊断和药敏分析,主要的原因除了成本较高外, 还在于WGS 检测一般需在获得Mtb纯培养物的基础上进行,因而极大地限制了这一技术的临床应用。近年来, 为了克服WGS 的这一不足,有些研究者尝试通过对临床标本进行快速预处理后再进行WGS 检测，如以快速液体培养阳性的培养物进行直接WGS 检测，结果发现以1ml 阳性的快速液体培养物直接进行核酸提取再进行WGS检测,可从所有阳性标本中获得高质量的测序结果[43,44]。此外，有研究报道通过采用DNA 浓缩试剂盒对临床痰标本中提取的DNA 标本进行富集后再进行WGS 检测,或以靶向结核分枝杆菌DNA 的生物素化的RNA 对标本中的结核分枝杆菌DNA 进行特异性捕获后再行WGS 检测均能取得较好的检测结果, 对于痰涂片抗酸阳性的痰标本，74%-83%的标本可获得测序结果[44,45]。这些研究提示通过优化检测流程应用WGS 进行临床标本的直接检测是可行的,但这一结论还需要更多临床研究的支持。

与WGS 不同，mNGS 不针对特定的病原体进行靶向测序,而是对标本中所有微生物的基因组进行高通量测序,再通过将测序获得的读数结果与微生物基因组文库中的序列进行比对,从而获取标本中微生物存在的信息,常用于临床复杂感染的病原体检测。近年来，mNGS 在Mtb 检测，尤其是在肺外结核检测中的性能也逐渐受到研究者的关注。一项对脑脊液标本进行的平行检测研究发现，mNGS诊断结核性脑炎的敏感性为66.67%,特异性为100%，显著优于抗酸染色法、培养法和PCR 法[46]。对结核病疑似患者的临床标本（包括痰标本、脑脊液和肿液等）采用mNGS、Xpert 和Mtb 培养法进行的平行检测发现，mNGS 诊断结核病 （包括肺结核和肺外结核） 的敏感性和特异性与Xpert 系统相当，显著优于培养法[47,48]。鉴于mNGS 可同时发现多种可能的病原体，mNGS 在检测病原体感染方面与靶向性的分子诊断比较有显著的优势,但mNGS 检测病原体的性能受测序深度影响,不同的测序深度可能导致同一份标本产生不同的检测结果，此外，高昂的检测费用在很大程度上限制了这一技术的推广应用[49]。

目前，已有多个国家和地区在使用WGS 技术进行耐药结核病的筛查[50]，部分结核病低发的国家和地区已批准采用WGS 技术进行一线抗结核病药物的耐药性检测[51]。鉴于NGS 技术良好的应用前景，WHO 于 2018 年发布了 NGS 在 Mtb 耐药性突变检测中的技术指南[52]，同时为了进一步规范对NGS 在结核病耐药检测中的结果解读，由梅琳达·盖茨基金会、关键路径研究所（C-Path），创新型新诊断基金会（FIND）和WHO 在内的多个机构共同倡议建立的关联测序结核病数据平台ReSeqTB 也开始支持高通量测序的数据分析，并已经被WHO所采纳[53]。综上，NGS 是一种非常有效的结核病诊断和药敏分析的技术平台， 但目前高昂的成本不太可能使其在短期内成为结核病诊断和药敏分析的常规方法。

4 基于宿主应答靶标和Mtb 循环游离DNA 检测的结核病分子诊断技术

结核病分子和病原学诊断的主要标本是痰,然而在某些情况下患者的痰标本并不容易获取，如无痰或少痰的患者、年老体弱的患者或儿童，在这些情况下结核病的诊断往往难以进行,因此,WHO2 014 年提出应重视开发基于非痰标本的结核病诊断技术[54],在此背景下基于宿主反应和Mtb 游离D NA 检测的结核病诊断方法受到大量研究者的关注。

基于宿主应答的结核病分子诊断的靶标主要包括两类,免疫细胞的转录本(mRNA)和非编码RN A 的检测。已有的研究显示，基于宿主应答靶标的分子诊断方法在结核病诊断中的整体准确性并不是很理想,但在区分活动性结核病和Mtb 的潜伏感染方面, 以及结核病预后评估方面有一定的价值[55-57]。

基于Mtb 游离DNA 检测的方法被证实是非痰标本诊断结核病, 尤其是肺外结核病的有效方法。如有研究显示，采用荧光定量PCR 技术检测确诊和疑诊腹部结核患者腹水标本中的Mtb 游离DNA 时,其敏感性和特异性为70.9%和97.1%,显著优于Xpert 技术[58]。然而，来自不同课题组的临床研究显示，以血液和体液中Mtb 游离DNA 为靶标的分子诊断技术对结核病的诊断敏感性从29%到79%不等，这些差异可能与采用的标本、核酸提取的方式和检测的靶基因不同有关,提示以Mtb 游离DNA 为靶标进行结核病的诊断并不稳定, 进一步对标本采集、核酸提取和检测的靶基因进行标准化可能有助于提高Mtb 游离DNA 检测在结核病诊断中的价值[59]，采用更为灵敏的检测技术，如dPCR和NGS 技术对循环Mtb 游离DNA 进行检测也是提高其检测性能的有效方法[29]。

5 挑战与希望

随着分子诊断技术的快速发展,近年来结核病的病原学确诊率逐年提高,接受耐药性检测患者的比例也有了显著提升。WHO 的统计数据显示,2019年约有57%的肺结核患者获得了病原学确诊，在获得病原学确诊的患者中有61%接受了耐药性检测,这一数据在 2017 年为 51%，2012 年仅为 7%[1]。然而，尽管取得了较大的进展，结核病的诊断仍面临巨大的挑战,漏诊和诊断延迟仍是阻碍结核病疫情防控的主要原因之一,尤其是在中低收入的国家和地区。WHO 的统计数据显示，全球每年仍有约300 万结核病患者未能获得诊断或未进行登记，在2019 年新发的耐多药结核患者中, 仅有约38%接受了适当的治疗[1]。

因此,大量涌现的高敏感性和高特异性的分子诊断技术并未从根本上改变结核病诊断的困境，其背后主要的原因在于这些新技术并未能得到很好的推广应用。有调查发现,在17 个主要的结核病高负担国家中,痰涂片抗酸染色仍是目前结核病诊断的最主要方法，而WHO 在十年前就开始推荐的Xpert 检测系统并未获得广泛的应用[60]。因此，从目前的现状来看单纯发展新的结核病诊断技术并不足以改变结核病防控面临的问题,推广这些技术可能更为重要。然而，高昂的检测成本又使得这些技术难以在短期内在中低收入国家和地区广泛推广,但世界上绝大部分的结核病患者恰恰分布在经济条件较差的中低收入国家,因此在全面衡量技术性能、 生物安全和经济可承受性的基础上发展适合中低收入国家实际情况的分子诊断技术,而非一味地追求兼具高敏感、全自动和更低生物风险的技术可能才是最有效的策略。在这一方面，印度研发的TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 检测系统是一个值得借鉴的经验。该系统虽然在操作简便性和生物安全风险防控方面不如Xpert 系统，但技术性能和检测时间与Xpert 系统相当，成本却远低于Xpert 系统。目前，TruenatMTB/TruenatMTBRif Dx 系统已经在印度得到了较广泛的推广，用以替代价格昂贵的Xpert 系统[61]。最近，该检测系统的技术性能也已经过WHO 专家组的论证并得到了 W HO 的推荐[1]。

另一个困扰结核病防控的问题在于结核病大多发生在医疗条件较差的偏远地区,这些地区的患者除了经济条件受限外,往往难以及时得到相应的医疗服务,尤其是对实验条件要求较高的分子诊断服务。因此除了进一步推广低检测成本的高效诊断技术外, 进一步发展适合偏远地区检测需求的POCT 快速检测系统也很有必要。目前，Xpert 系统和TruenatMTB/TruenatMTB-Rif Dx 系统都推出了相应的POCT 检测平台，WHO 也在大力提倡开发更为低廉、灵活的POCT 检测系统用于偏远地区的结核病诊断[1]。因此，我们有理由相信在不久的将来，更加便捷、高效且适合中低收入国家推广使用的结核病分子诊断技术将得到快速发展，为结核病患者的及时诊治提供更好的服务， 同时为全球结核病疫情的防控发挥更加积极的作用。