咽拭子擦拭检测皮肤疣人乳头瘤病毒分型的敏感性研究

明 星，尹萌萌，李 京，吕世超

皮肤疣是由人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起的常见皮肤病，临床分为寻常疣、跖疣和扁平疣。根据基因的同源性，HPV 分为5 个属（α、β、γ、mu、nu）和16 个种，共350多个型[1,2]，其中α 属的HPV-2、3、7、10、27 和57 型，γ 属的HPV-4、60 和65 型，mu 属的HPV-1 和63 型，nu 属的HPV-41 型是与皮肤疣相关的型别[3]。感染国外寻常疣、跖疣及国内成人跖疣患者的主要HPV 型均为mu 属的 1 型和α 属的2、27、57 型[4-7]。研究发现HPV 型别与患者临床特征、自然消退率和水杨酸、液氮冷冻治疗效果相关[4,7]，因此检测皮肤疣患者的HPV 型别，可帮助临床医生选择治疗方案（治疗或观察），也是研究“精准”治疗皮肤疣的基础。准确检测皮肤疣HPV 型别不仅依赖正确的检测方法，也依赖敏感性好的取材方法。

手术刀片刮除和剪刀剪除部分疣体是国内检测皮肤疣HPV 型的取材方法[8-10]，这两种方法是侵入性操作，不仅易出血、引起患者恐惧、疼痛，导致依从性差，而且耗时长，不利于大规模临床和流行病学调查研究。de Koning 等[11]发现棉签擦拭可作为检测皮肤疣HPV 型的取材方法，但存在标本易交叉污染和样本处理相对复杂的缺点。 用独立包装的咽拭子取材能改善手术刀片刮除和棉签擦拭取材的不足。本研究探讨咽拭子擦拭法在皮肤疣标本检测HPV 型的敏感性，研究结果有助于改进检测皮肤疣HPV 型的取材方法，有助于临床和科研工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 2019 年3 月―2019 年4 月招募安徽医科大学解放军第306 临床学院和北京大学第三医院皮肤科门诊的皮肤疣患者50 例，其中跖疣34 例，寻常疣16 例。寻常疣皮损分布于头皮3 例、面部2 例、后背部1 例、手部8 例、足背2 例。50 例患者中男35 例，女15 例，平均年龄34.38 岁（10 ～85 岁），平均病程13.28 个月（0.25 ～120 个月），平均疣体为3.8 个（1 ～30 个）。取材前均取得患者同意。

1.1.2 主要试剂 咽拭子（青岛永强华商医疗科技公司），15 号一次性使用无菌手术刀片（上海复星医药股份有限公司），冻存管（北京兰杰柯科技有限公司）， 组织DNA 提取试剂盒、ETP-300 全自动核酸提取仪（上海英芮诚公司），HPV L1 区引物（北京天一辉远生物科技有限公司），KAPA 扩增试剂盒、TaKaRa 纯化试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，9700 PCR 扩增仪、3730XL 测序仪(美国ABI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 确定取材的靶疣 首选第1 个发生的疣，不能确定第1 个疣，选择面积最大的疣。

1.2.2 咽拭子擦拭法取材 用细胞保存液浸湿的咽拭子采样头擦拭靶疣表面10 次后，将采样头置于细胞保存液中，编号后置于-18℃冰箱中保存，待测HPV型。

1.2.3 刀片刮除法取材 咽拭子取材后，用15 号无菌手术刀片在同一个疣体的表面刮除部分疣体组织，置于2 ml 的冻存管中，编号后置于-18℃冰箱中保存，待测HPV 型。

1.2.4 检测方法 样本裂解后，利用组织DNA 提取试剂盒和全自动核酸提取仪提取标本中的病毒DNA,实验步骤按说明书进行；利用HPV L1 区引物（正向引物5'- CARGGTCAYAAYAATGGYAT -3'，反向引物5'- AAYTTTCGTCCYARAGRAWATTGRTC -3'）按KAPA 扩增试剂盒说明书扩增提取后的DNA；按TaKaRa 试剂盒说明书回收纯化扩增产物，通过自动测序仪测序；最后经NCBI-BLAST 数据库比对确定HPV 型，通过TA 克隆技术区分混合型别。

1.3 统计学方法

年龄、病程、疣体个数用均值表示，通过与刀片刮除组的HPV 型检测结果比较，计算咽拭子擦拭组的敏感性。咽拭子擦拭法的敏感性=咽拭子擦拭组中与刀片刮除组中HPV 型检测结果一致的样本例数÷刀片刮除组HPV 检测阳性总例数。

2 结果

刀片刮除组的HPV 检测阳性率为100%（50/50），其中HPV1、HPV27、HPV2 和HPV57 型分别为18 例、14 例、7 例和3 例，HPV1 和27、HPV1 和2、HPV2和27 分别为6 例、1 例和1 例。咽拭子擦拭组的检测阳性率为92%（46/50），其中除1 例患者的HPV型检测结果是HPV1，而刀片刮除组为 HPV1 和27 外，其余阳性检测结果和刀片刮除组完全一致。咽拭子擦拭法的敏感性为92%（46/50）。

3 讨论

本研究采用咽拭子取材，PCR 技术扩增病毒DNA、Sanger 法（DNA 双脱氧链末端终止测序法）测序和TA 克隆技术区分混合型别。与棉签取材相比，独立包装且配有细胞保存液的咽拭子发生交叉感染的可能性更小，且避免了棉签取材需加入生理盐水和DNA 提取需人工挤压棉签的步骤，操作更快捷。另外，咽拭子采样头由尼龙短纤维绒毛头构成，能有效吸附脱落细胞，较棉签头更易洗脱细胞，理论上可提高阳性检出率。选择HPV 病毒衣壳蛋白L1 区最保守、变异最少的核苷酸序列为扩增引物，可以检测出所有的HPV 亚型[1]。Sanger 法是最早最经典的测序方法，准确率高达99.99%[12]。TA 克隆技术具有操作简单、快速、重组高效等优点[13]。

既往研究发现采用PCR 技术检测刀片刮除皮肤疣疣体组织的HPV 阳性率为97%[8]，本研究刀片刮除组的阳性率为100%，因此可以将刀片刮除法作为标准，计算咽拭子擦拭法的敏感性。研究结果显示咽拭子擦拭组46 例皮肤疣标本HPV 阳性，其中45 例和刀片刮除组HPV 分型完全一致，仅1 例患者HPV为1 型，而刀片刮除组为1 和27 型（25 号患者）。咽拭子擦拭法的敏感性为92%，与de Koning 等[11]报道棉签擦拭法的敏感性为96%（24/25）基本一致。另外，咽拭子擦拭组有4 例样本HPV 阴性，而刀片刮除组是阳性，导致这一结果的原因可能是咽拭子擦拭法与刀片刮除法相比获得的病毒载量少（包括25号患者），影响了样本的检测结果。如果增加咽拭子擦拭皮肤疣的次数，可能会提高检测结果的阳性率和咽拭子擦拭法的敏感性。根据以上研究结果，并考虑到咽拭子擦拭法的优势，该方法可作为检测皮肤疣HPV 分型的常规取材方法。有文献报道HPV 可存在于正常人皮肤表面[14,15]和许多皮肤病皮损中，如银屑病、红斑狼疮、脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌等[16-21]，因此很难取到可靠的阴性对照标本，所以本研究未涉及咽拭子擦拭法的特异性研究。

本研究检测结果显示感染寻常疣和跖疣的主要HPV 型是HPV1、2、27 和57 型，和国内外既往研究结果一致[4-8]。