基因探针技术在食品卫生检测中的应用分析

胡云轩，杨土保

（中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙 410008）

人类食品必须具备的条件除本身的营养价值外，还不应对人体产生毒害作用。食品卫生检测目的是及时检测出食物有害部分，可分为生物性危害、有害化学物质、物理性污染三方面的检测，其中归属于生物性危害的病原性微生物是食品安全最大危害。传统病原性微生物检测基本通过物理方法（显微镜技术、染色技术等）与生化方法（淀粉水解试验、甲基红试验等）[1]进行，成本要求高、效率低、速度缓慢、部分有害物质难以检测[2]。基因探针技术作为现代社会食品卫生检测技术的一种手段，不仅克服了传统的食品卫生检测中的不足，还具有强特异性、高灵敏度等优点。

1 基因探针技术的食品卫生检测原理

基因探针技术又称DNA探针技术[3]、分子杂交术，可用来检测食品中有害微生物。碱基互补配对条件下的核酸杂交是主要的检测原理，经过处理的两条碱基互补的DNA链在合当条件下按互补配对原则，人工形成杂交DNA分子。由于病原性微生物的形态和特性很大程度由基因决定，每种病原微生物都有独特的DNA序列排序，将某种病原微生物进行基因标记制成标记性基因探针（如用32P同位素标记、生物素标记等），根据碱基配对，通过考察待测样本与标记性基因探针能否形成杂交分子，就可以判断样本中是否含有此种病原性微生物（目前大肠杆菌、李斯特氏菌、葡萄球菌等较为常用[4]）。通过测定放射性的强度，还可以间接考察样品微生物的具体数量。

2 基因探针技术的进展

自1975年Southern第一次提出基因探针杂交技术以来，该技术成为现代生物学卫生检测中的重要技术手段。目前基因探测手段分为两类[5]：一种称为异相杂交技术或固相杂交技术（常见有Southern印迹法、非放射性DNA探针、DNA生物传感器探针等）；另一种称同相杂交技术或液相杂交技术（常见有双探针常规技术、分子信标探针等）。

2.1 异相杂交技术

异相杂交也被称之为固相杂交，主要在溶液环境中进行，参与反应的DNA一条单链以游离的形态存在于溶液中，另一条单链固定于固相支持物（硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等）上，在检测过程中，与底物相结合的单链被固相支持物固着，未与底物结合的单链在溶液中洗脱。一旦反应产物固着，则不易洗脱，因而在食品卫生检测中最为常用。异相杂交技术的印迹法是最早的基因探针杂交技术，最早由同位标记法记录。随着技术的进展，更多食品卫生检测逐渐采用放射性探针。放射性强度越强，检出阳性率越高，检测结果也就越好。

基因生物传感器探针技术是近些年发展的基于基因探针技术与生物传感器技术的新手段。基因生物传感器探针技术的原理是把基因探针固定在物体的表面，通过适当的传感器与信号放大装置，将反应转变成可定量的电、光等物理信号从而能够进行食品卫生检测与监控[6]。

2.2 同相杂交技术

同相杂交技术也被称为液相杂交，与异相杂交相比不需要固定基因、删除没有杂交基因等操作。同相杂交的两个标记探针主要在溶液中与目标基因杂交，根据分子量的不同通过平衡密度梯度离心分离杂交体，从而得出检测结果。但是杂交完成后未互补配对或操作失败的成分混杂于液相中，导致最终结果准确度与精确度不高[7]。

分子信标探针技术是近年来的热门话题，其主要原理是荧光共振能量转移，在探针末端进行荧光标记，只有完全互补的基因才可以与分子信标探针进行杂交，由此可见分子信标探针技术具有非常高的特异性[8-9]。

2 PCR技术与探针检测技术联合

PCR技术又被称之为聚合酶链式反应技术，经过多年的研究发展运用到食品安全与食品卫生检测的领域当中[10]。PCR技术通过变性、退火、复火、延伸四个步骤可以大量拷贝出食品致病菌的某一特定基因排列顺序。该技术只需要很少量的待检测微生物，就能扩增出满足实验检测需要的片断以进行定性定量分析，因此，PCR的技术常常与DNA探针技术联合运用。利用PCR的技术可以大大提高基因探针技术在食品卫生检测中的灵敏度。将其用做食物中少量病原微生物的检测技术手段，大大提高了基因探针技术在食品卫生检测中的应用。但是PCR技术对实验室的精密度与操作人员的业务能力有着很高的要求，涉及操作复杂，技术含量高，现阶段无法大范围普及。

3 基因探针技术在食品卫生检测中的应用

3.1 基因探针的构建

近年来基因探针技术在食品卫生检测中起了重要作用[11]，目前基因探针技术可以用来检测食物中含有的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶希氏菌、李斯特菌等。基因探针构建的成功与否很大程度决定实验是否失败。在食品卫生检验中，微生物种属所特有的基因序列（也被称为特异性保守序列）是探针构建的关键，该基因序列的保守性有利于提升检测的精确性。

3.2 基因探针的优点

传统微生物检测方法一般涉及对病原微生物的培养、形态学以及理化特性的分析，在多年实际运用中已经证明其具有一定的有效性与特异性，但病原微生物的生存条件、生长速度、检测方法固有缺陷使其运用范围局限。由于需要对病原微生物的人工培养，所以传统检测方法局限于已知种类的微生物，对未知病原微生物的培养具有着盲目性。基因探针技术与之相比，不仅仅能克服以上所述传统微生物检测方法的不足，还可与PCR技术、生物芯片技术、免疫酶联技术等多种新技术等相结合，大幅度提升了检测的灵敏性、特异性，运用范围也大幅度地拓宽。

3.3 注意事项

为了确保食品卫生检测的准确度，一定要根据确定具体的检测目标，制造不同基因探针。建立检测食品卫生中微生物基因探针的基础原则用来检查微生物的排列标准和顺序，并以特异性的保守基因排序作为基因目标，把这种排序的互补基因作为杂交探针技术。对于一些微生物来说，可以把微生物特有的生理基因变化来决定独特排列的基因探针技术。例如和其他的微生物比较，大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特异性，可用来检测食品中含有的总大肠杆菌数量，从而检测食品卫生情况。

3.4 基因探针技术在食品检验中的应用成果

①美国Gene-Trak公司开发出检测食品中大肠杆菌的商品级基因探针系统，先联合PCR技术扩增目标DNA片段，达到检测数量级后即可基因探针检测，该系统无需传统微生物培养，可快速精准完成检测。②Moseley利用生物标记克隆沙门氏菌DNA片段作为基因探针，检测饮用水、食物、饲料中的沙门菌属。③对于不同种类大肠杆菌，如ETEC、EHEC、EPEC等，最新研究通过其特有的产毒基因序列、肠出血基因序列、致肠病基因序列的基因探针的精细构建，可用于鉴别。

3.5 存在的问题

①在基因探针的构建方面：若用同位素进行标记，需考虑同位素的半衰期以及放射性核素对人体的影响，尤其是食品领域，更需要进一步完善；若用生物素标记，在紫外线下容易分解，尤其食品领域中内源性生物素化蛋白和糖蛋白常引起背景加深与一系列非特异反应。②在基因探针的特异性方面，该技术更适用于已知序列的病原微生物，若病原微生物未知，检测有很强盲目性。③在实际运用中，菌落杂交的敏感性也受菌落杂交的影响，同时对技术人员、实验环境要求高，广泛运用受限，需要更加精细的技术支持。

现阶段传统方法仍在食品卫生检测中最常用，存在着成本较高、浪费时间较长等问题。有些微生物不能人工进行培养或者培养条件苛刻、生长周期长的特性使利用微生物传统检测方法在食品卫生检测中困难重重，越来越多的问题急需解决。例如使用葡糖苷酸酶鉴别检测大肠杆菌是现在日本和美国常用的检测食物卫生标准的方法，但多次检测已发现几种因基因突变而产生的假阴性卫生检测结果。社会发展对食品卫生检测提出了强特异性、高灵敏度和操作简单、节省时间等方面的要求。基因探针技术在食品卫生检测中的应用具有重大的现实意义。