皮质醇固相放射免疫分析方法的建立

刘洪奎

（北京北方生物技术研究所有限公司，北京 100076）

1 材料与方法

1.1 材料

主要仪器与试剂

伽马放射免疫计数器为安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；

皮质醇抗原、兔抗-皮质醇抗体、放射性核素Na125I溶液、驴抗兔血清、聚苯乙烯试管、皮质醇液相RIA药盒均由北京北方生物技术研究所有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 驴抗兔抗体亲和纯化

利用本公司专利技术，将驴抗兔血清进行亲和纯化，得到亲和纯驴抗兔抗体。

1.2.2 标准品配制

用标准品稀释液将皮质醇配制成系列浓度点，以0.5 mL每瓶分装，4℃保存。

1.2.3 皮质醇抗体包被管制备

用二抗包被液将驴抗兔配成合适浓度后进行第一层包被，再用一抗包被液将皮质醇抗体配成合适浓度后进行第二层包被，最后加入封闭液抽干干燥，4℃保存。

1.2.4 125I-皮质醇标记抗原制备

皮质醇标记抗原采用氯胺-T法进行皮质醇标记抗原的125I标记，检验合格后按要求分装，4℃保存。

1.2.5 放免分析程序与统计学方法

取20 μl皮质醇标准品或样品加入抗体包被管中，加入200 μl125I-皮质醇标记抗原，37℃水浴1小时，吸弃反应液并洗涤一次，测定各管的CPM放射性计数。以标准品浓度为横坐标，以放射性计数值为纵坐标，以Logit-log 直线回归制作标准曲线，最后计算出样品中皮质醇的含量。

2 结 果

2.1 方法学优化

参照本公司皮质醇液相放射免疫分析药盒的经验方法，通过固定125I-皮质醇标记抗原的量来选择抗体包被管的包被浓度。本方法学反应温度采用37℃温育，通过研究反应时间确保反应达到平衡状态。

2.1.1 驴抗兔抗体浓度的选择

将纯化的驴抗兔抗体稀释成5个浓度，包被于聚苯乙烯空白试管；再包被足量的抗体。实验结果表明：当驴抗兔抗体浓度达到20 μg/mL时，可以满足实验需求。

2.1.2 皮质醇抗体滴度的选择

将抗体稀释成5个滴度，进行包被，实验结果表明：当抗体滴度达到1：3000时，处于比较合适的位置，最终选择抗体包被滴度为1：3000。

2.1.3 反应时间的选择

选择五个反应时间进行37℃温育。实验结果表明：当反应时间达到60 min时达到平衡点，即反应条件为37℃温育1 h。

2.2 方法学鉴定

2.2.1 标准曲线

通过方法学建立，得到的皮质醇固相放射免疫分析方法的标准曲线。测量范围为10～500 ng/mL，标准曲线方程为y=-1.61，x=-0.06，r=0.999。

2.2.2 灵敏度

测定20个“零”标准的计数值，求出X-2SD值,并将此值代入标准曲线方程，计算出对应的浓度为0.38 ng/mL，即为此方法学的灵敏度。

2.2.3 精密度

对2份含低、高浓度的血清样品分别在一次实验中平行多管测定和在不同实验中重复测定，得到批内变异系数为3.20%～4.53%，批间变异系数为4.84%～6.76%，可见本方法的精密度较好，符合免疫分析的要求。

2.3 方法学比较

用本方法分别与液相RIA方法同时测量93份血清样品，对样品值进行比较。可知本方法与液相RIA方法的相关性方程为y=0.984x+2.089，相关系数r=0.991。说明本方法与市场上合格的液相放射免疫分析方法具有良好的相关性。

2.4 稳定性

将皮质醇RIA药盒置于37℃ 0、1、3、7、10d进行放射免疫分析考查其稳定性。可知皮质醇RIA药盒在37℃存放10天能保持良好的稳定性。

3 讨 论

皮质醇对鉴别诊断Addison和Cushing病，垂体功能减退症，肾上腺增生，糖尿病和癌症非常有等均具有重大的临床意义。以固相RIA技术（包被管分离）取代传统的液相RIA技术（分离剂法分离），使得操作更加简便快速，可适合大量临床样品的检测，尤其是以洗涤代替离心，不仅降低了非特异性结合，提高了精密度和准确性，更能推动RIA朝自动化操作发展。